Bipolarna Integracyjna Staging: Włączanie Biomarkerów w Progresję przez Etapy (BOARDING-PASS)

Uzasadnienie Zaburzenie afektywne dwubiegunowe (ZAD) jest schorzeniem o wysokiej rozpowszechnieniu (około 1% w populacji ogólnej) i powodującym niepełnosprawność, charakteryzującym się przewlekłym i postępującym przebiegiem. Naturalna historia ZAD zwykle obejmuje początkową fazę bezobjawową, po której następuje stadium prodromalne, a następnie wystąpienie pierwszego epizodu syndromicznego (depresyjnego lub maniakalnego), po którym zazwyczaj występują nawracające epizody, często bez pełnego powrotu do zdrowia między epizodami. Rosnąca liczba dowodów wspiera koncepcję, że długoterminowy przebieg ZAD wiąże się z aktywnym procesem neuroprogresji, charakteryzującym się postępującymi zmianami w mózgu i upośledzeniem funkcjonalnym. Na przebieg zaburzenia może wpływać kilka czynników klinicznych, w tym liczba epizodów afektywnych, obecność współistniejących chorób psychiatrycznych i somatycznych, narażenie na stresujące wydarzenia życiowe oraz rodzinny wywiad psychiatryczny. Badania neuroobrazowe konsekwentnie wspierały hipotezę neuroprogresji w ZAD, wykazując strukturalne i funkcjonalne zmiany w mózgu, które pojawiają się stopniowo w miarę postępu choroby. Nieprawidłowości opisano również na poziomie sieci neuronalnych o dużej skali. W szczególności sieć trybu domyślnego wydaje się wykazywać zmienione wzorce hiper- i hipokonektywności z układami afektywnymi, czołowo-ciemieniowymi i uwagowymi, obejmującymi kluczowe węzły odpowiedzialne za efektywną komunikację w mózgu na dużą skalę. Ponadto, zmiany strukturalne i funkcjonalne zidentyfikowano również u zdrowych krewnych pacjentów z ZAD. Badania dotyczące dodatkowych biomarkerów w ZAD dostarczyły dalszych dowodów wspierających progresję zaburzenia związaną ze stadium, zwłaszcza w odniesieniu do neurotroficznego czynnika pochodzenia mózgowego (BDNF) i cytokin zapalnych. Ogólnie rzecz biorąc, ostatnie postępy w dziedzinie klinicznego określania stadium ZAD, wraz z postępem w identyfikacji markerów biologicznych (np. modulacja transkrypcji genów, sygnalizacja neurotroficzna, szlaki immunologiczno-zapalne, mikrobiota) i neuroobrazowania (struktura i funkcja systemów mózgowych o dużej skali), dostarczają silnego uzasadnienia dla opracowania wielowymiarowego modelu określania stadium. Taki model integrowałby dane kliniczne i neurobiologiczne, umożliwiając większą precyzję diagnostyczną, prognostyczną i terapeutyczną.

Cele szczegółowe i schemat badania

Badanie BOARDING PASS ma następujące cele:

1. długoterminowa ocena progresji klinicznej ZAD w okresie 18 miesięcy przy użyciu modelu określania stadium Kupki i Hillegers;
2. zbadanie roli markerów biologicznych i neuroobrazowych w przejściach między stadiami ZAD (tj. regulacja transkrypcji genów, stan zapalny, mikrobiota, pomiary neuroobrazowe strukturalne i funkcjonalne);
3. wdrożenie predykcyjnego modelu ML opartego na integracji danych klinicznych, biologicznych i neuroobrazowych, w celu zapewnienia zindywidualizowanej i opartej na danych predykcji przejść między stadiami ZAD.

Badanie obejmuje kolejne rekrutowanie 120 osób w trzech z czterech uczestniczących ośrodków: UO1 (ASST Fatebenefratelli-Sacco, Mediolan), UO2 (ASST Papa Giovanni XXIII, Bergamo) i UO3 (ASL 2 Abruzzo, Lanciano-Vasto-Chieti). Kryteria włączenia i wykluczenia szczegółowo opisano poniżej.

Kryteria włączenia:

1. Osoby chore i zdrowe na ZAD, których stadium kliniczne mieści się w zakresie zdefiniowanym przez model Kupki i Hillegers, a mianowicie:

   stadium 0 (zwiększone ryzyko: posiadanie krewnego pierwszego stopnia z ZAD, przy braku objawów psychiatrycznych); stadium 1 (posiadanie krewnego pierwszego stopnia z ZAD, przy obecności niespecyficznych objawów psychiatrycznych lub epizodu/ów depresyjnych); stadium 2 (pierwszy epizod hipo/maniakalny umożliwiający rozpoznanie ZAD typu I lub II według DSM-5; APA, 2013); stadium 3 (nawracający/e epizod/y: depresyjny/e, hipo/maniakalny/e lub mieszany/e); stadium 4 (utrwalone zaburzenie bez remisji: przewlekłe epizody depresyjne, maniakalne lub mieszane, w tym szybka zmiana faz);

2. Osoby obu płci;
3. Wiek ≥ 18 lat i ≤ 70 lat;
4. Zdolność do wyrażenia ważnej pisemnej świadomej zgody.

Kryteria wykluczenia:

1. Niezdolność do wyrażenia ważnej pisemnej świadomej zgody;
2. Obecność niepełnosprawności intelektualnej;
3. Obecność ciężkiej współistniejącej choroby somatycznej;

4. Obecność aktualnego zaburzenia związane z używaniem substancji. Po wyrażeniu pisemnej świadomej zgody na udział, włączeni uczestnicy przejdą ocenę wyjściową (T0), a następnie rozpoczną 18-miesięczny okres obserwacji składający się z trzech kolejnych punktów czasowych: T1 (6 miesięcy po T0), T2 (12 miesięcy po T0) i T3 (18 miesięcy po T0). W T0 i w każdym kolejnym punkcie czasowym ocena uczestnika będzie obejmować: (i) ocenę kliniczną i psychometryczną; wyłącznie w T0, T2 i T3, (ii) ocenę markerów biologicznych; oraz (iii) obrazowanie mózgu metodą rezonansu magnetycznego w celu pozyskania danych strukturalnego i funkcjonalnego MRI.

   Ocena kliniczna i psychometryczna

   Na początku badania (T0) dla każdego uczestnika badania zostaną zebrane główne zmienne socjodemograficzne i kliniczne i wprowadzone do anonimowej bazy danych. Obejmują one:

   (a) dane socjodemograficzne: wiek, płeć, pochodzenie etniczne, poziom wykształcenia, stan cywilny i status zawodowy; (b) cechy kliniczne: rodzinny wywiad psychiatryczny, podtyp ZAD, wiek początku ZAD i związane z nim stresujące wydarzenia życiowe, czas trwania choroby, czas nieleczonej choroby, wiek przy pierwszym epizodzie depresyjnym i hipo/maniakalnym, polarność pierwszego i ostatniego epizodu afektywnego, polarność dominująca, całkowita liczba epizodów afektywnych w życiu, obecność cech mieszanych lub szybkiej zmiany faz, obecne i wcześniejsze leczenie psychofarmakologiczne, współistniejące choroby somatyczne i psychiatryczne, wywiad dotyczący zaburzeń związanych z używaniem substancji, liczba hospitalizacji w życiu oraz próby samobójcze.

   Zmienne te zostaną wykorzystane do przypisania stadium klinicznego w T0 zgodnie z modelem Kupki i Hillegers (Kupka & Hillegers, 2012). W każdym kolejnym punkcie czasowym dane socjodemograficzne i kliniczne zostaną zaktualizowane w celu ponownego przypisania odpowiedniego stadium oraz oceny potencjalnych związków między zmiennymi klinicznymi a prawdopodobieństwem progresji do bardziej zaawansowanych stadiów choroby.

   Ocena kliniczna będzie ponadto obejmować przeprowadzenie następujących skal i kwestionariuszy psychometrycznych: Test di Intelligenza Breve (TIB; Sartori, 1997; Colombo, 2002), czas przeprowadzenia około 5 minut; Skala Depresji Hamiltona (HDRS-21; Hamilton, 1960; Cassano i in., 1991), czas przeprowadzenia około 20 minut; Skala Lęku Hamiltona (HARS; Hamilton, 1959; Cassano i in., 1991), czas przeprowadzenia około 15 minut; Skala Depresji Montgomery'ego-Åsberga (MADRS; Montgomery & Åsberg, 1979; Palma i in., 1999), czas przeprowadzenia około 15 minut; Skala Manii Younga (YMRS; Young i in., 1978; Palma i in., 1999), czas przeprowadzenia około 15 minut; oraz Globalna Ocena Funkcjonowania (GAF; Hall, 1995; APA, 1996), czas przeprowadzenia około 2 minut; Wywiad Rodzinny do Badań Genetycznych (FIGS); Test Przesiewowy Nadużywania Narkotyków (DAST-10), czas przeprowadzenia szacowany na około 5 minut. Test TWEAK z czasem wykonania około 2 minut. Kwestionariusz Traum Dziecięcych (CTQ), wymaga 5-10 minut i zostanie przeprowadzony na początku badania. Skala Paykela dla Ostatnich Wydarzeń Życiowych, jej przeprowadzenie zajmuje około 15 minut i zostanie wykonane na początku badania; Skala Oceny Klinicysty (CRS), rejestrowana w około 2 minuty w każdym punkcie czasowym, mająca na celu ocenę przestrzegania przez pacjentów leczenia farmakologicznego.

   Ocena markerów biologicznych: Regulacja transkrypcji genów, stan zapalny, dane mikrobiomu

   Próbki biologiczne do analiz ekspresji genów, stanu zapalnego i mikrobiomu będą zbierane na początku badania, w T2 i T3. Szczegółowo:

   1. próbki śliny niestymulowanej - tj. pełna ślina zebrana w warunkach spoczynkowych bez stymulacji smakowej, żucia lub farmakologicznej - będą pozyskiwane przy użyciu wacików policzkowych (Salivette, Sarstedt, Nümbrecht, Niemcy) i przechowywane w -20 °C do ekstrakcji genomowego DNA (gDNA). Egzosomy będą również izolowane ze śliny, a miRNA oczyszczane przy użyciu zestawu do izolacji RNA egzosomów.

   2. próbki krwi żylnej obwodowej będą pobierane do dwóch probówek vacutainer o pojemności 5 ml zawierających cytrynian sodu. Surowica i składniki komórkowe zostaną oddzielone, a całkowite RNA oraz gDNA zostaną wyizolowane z PBMC.

      Wszystkie próbki biologiczne zebrane w trzech ośrodkach rekrutacyjnych (Jednostki 1, 2 i 3) zostaną przekazane do centralnego laboratorium (Jednostka 4) w celu ujednoliconego przetwarzania i analiz, w tym:

      - LIPIDOMIKA do analizy krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych (SCFA) wyekstrahowanych ze śliny; zostanie przeprowadzona derywatyzacja do analizy LC-MS/MS.

      Badania biologii molekularnej:

      - analiza ekspresji genów. Względna obfitość gatunków mRNA w PBMC będzie oceniana metodą real-time RT-PCR i Digital PCR.

      - metylacja DNA zarówno w komórkach krwi, jak i śliny a. ogólny status metylacji DNA będzie analizowany metodą sekwencjonowania reprezentatywnego bisulfitowego (RRBS) (sekwencjonowanie SBS na platformie SURFseq5000); b. badanie specyficznej metylacji genów będzie przeprowadzone na amplifikowanym DNA potraktowanym bisulfitem (BS), a poziomy metylacji analizowane przy użyciu PyroMark Q48 (64).

      - egzosomalne miRNA ze śliny: analiza miRNOme i wyselekcjonowanych miRNA po analizie sieciowej metodą RealTime PCR i Digital PCR.

      • Wiazanie czynników transkrypcyjnych z DNA. Technika ALPHAScreenTM do weryfikacji, czy zidentyfikowane elementy rozpoznania w promotorach genów wiążą się z różnymi czynnikami transkrypcyjnymi i czy to wiązanie jest bezpośrednio modulowane przez stopień metylacji motywów CpG.
      • SKŁAD MIKROBIOTU ŚLINY przez sekwencjonowanie mikrobiomu 16S rRNA.

      Ocena neuroobrazowa

      Badania MRI będą przeprowadzane przy użyciu skanerów 3T w T0, T2 i T3 i obejmować:

      - Strukturalne MRI (sMRI): obrazy 3D ważone T1 będą pozyskiwane przy użyciu sekwencji SPGR (TE = minimum (pełne); kąt odchylenia, 6°; FOV, 250 mm; szerokość pasma, 31,25; matryca, 256 x 256) z 124 plastrami osiowymi o grubości 1,3 mm. Po rekonstrukcji powierzchni korowej, lokalne wskaźniki zakręcania będą obliczane dla 68 sparcjalizowanych regionów korowych na podstawie atlasu Desikana przy użyciu FreeSurfer v7.1.0. Następnie zostanie zastosowana procedura estymacji obciążenia jackknife do określenia wkładu każdej osoby w kowariancję na poziomie grupy, generując indywidualną macierz odległości 68×68. Organizacja topologiczna wynikowych sieci kowariancji strukturalnej będzie następnie analizowana przy użyciu Graph Analysis Toolbox.

      - Funkcjonalne MRI stanu spoczynkowego: obrazy rs-fMRI będą pozyskiwane przy użyciu sekwencji gradient-echo EPI z 36 plastrami osiowymi (TE = 30 ms; TR = 2000 ms; rozmiar woksela: 3×3×4 mm3; rozmiar matrycy: 64×64; FOV: 192×192 mm2);, pozyskiwane w kolejności przeplatanej. Każda sesja stanu spoczynkowego będzie składać się z 400 objętości. Wstępne przetwarzanie będzie prowadzone przy użyciu kombinacji FMRIB's Software Library (FSL) i własnych skryptów MATLAB. Potok będzie obejmował następujące kroki: (1) reorientacja do przestrzeni standardowej; (2) wykrywanie odstających objętości, a następnie interpolacja oparta na splajnach odstających punktów czasowych; (3) przetwarzanie przestrzenne i czasowe, w tym korekcja ruchu (MCFLIRT), filtrowanie górnoprzepustowe czasowe i wygładzanie przestrzenne (FWHM = 5 mm); (4) ekstrakcja mózgu z obrazu strukturalnego; (5) nieliniowa rejestracja do standardowej przestrzeni MNI152 przy użyciu FSL-FNIRT. Statyczne i dynamiczne funkcjonalne konektomy będą szacowane przez obliczenie z-transformowanych współczynników korelacji Pearsona między wszystkimi parami regionów mózgu w przyjętym schemacie sparcjalizacji. Konektywność dynamiczna będzie obliczana przy użyciu podejścia z przesuwanym oknem o długości okna 30 TR i kroku 2 TR. Kroki te będą implementowane przez wewnętrzne oprogramowanie opracowane w MATLAB. Miary teorii grafów będą obliczane za pomocą Brain Connectivity Toolbox (MATLAB).

      Aby zminimalizować zmienność między ośrodkami w danych neuroobrazowych, zarówno strukturalne, jak i funkcjonalne akwizycje MRI będą wykonywane przy użyciu ujednoliconych protokołów w dwóch ośrodkach obrazowania, każdy wyposażony w skaner 3 T. Algorytmy ML Zostanie opracowane ramy ML do przewidywania przejść między stadiami klinicznymi w ZAD poprzez integrację zebranych danych klinicznych, biologicznych i neuroobrazowych. Aby zarządzać integracją danych multimodalnych, przyjmiemy solidne potoki wstępnego przetwarzania obejmujące normalizację danych, wykrywanie wartości odstających oraz metody imputacji do obsługi brakujących wartości (np. k-najbliższych sąsiadów lub wielokrotna imputacja). Analizy ML rozpoczną się w 6 miesiącu badania i będą prowadzone przy użyciu Statistics and Machine Learning Toolbox MATLAB, początkowo wspierane przez oprogramowanie NeuroMiner (http://proniapredictors.eu/neurominer/index.html), zweryfikowaną platformę programową zaprojektowaną do zarządzania heterogenicznymi zestawami danych. NeuroMiner zapewnia szeroki zakres ram walidacji krzyżowej, strategii wstępnego przetwarzania, algorytmów uczenia nadzorowanego, narzędzi selekcji cech i metod walidacji zewnętrznej. Podejście ML będzie oparte na klasyfikatorach nadzorowanych, głównie maszynie wektorów nośnych (SVM) i modelach bayesowskich. W fazie wstępnej klasyfikatory będą trenowane i testowane na wstępnych zestawach danych w celu porównania alternatywnych modeli predykcyjnych w kontrolowanym środowisku i zidentyfikowania najlepiej działającej konfiguracji algorytmicznej. Następnie zostaną zastosowane procedury selekcji cech w celu zidentyfikowania najbardziej dyskryminacyjnych zmiennych z puli kandydackich cech. Ten krok jest kluczowy dla poprawy interpretowalności modelu i zapobiegania przeuczeniu, szczególnie w małych próbkach, wielowymiarowych zestawach danych typowych dla badań multimodalnych. W rzeczywistości, poprzez redukcję liczby zmiennych wejściowych, selekcja cech minimalizuje szum, zmniejsza złożoność modelu i poprawia uogólnialność predykcji ML. W razie potrzeby (tj. jeśli wymiarowość przestrzeni cech jest nadal zbyt wysoka), w celu dalszej redukcji przeuczenia i obciążenia obliczeniowego, może zostać zastosowana Analiza Głównych Składowych. Klasyfikatory SVM będą priorytetowe ze względu na ich solidność w obsłudze wielowymiarowych danych z małymi próbkami. Dodatkowo, zostanie zastosowane ważenie klas, tak aby błędy na mniejszych stadiach były bardziej karane, redukując błąd wprowadzany przez nierówne rozmiary grup. Wydajność modelu będzie oceniana przy użyciu technik walidacji krzyżowej (np. leave-one-out lub stratyfikowana k-fold, w zależności od struktury danych i rozkładu klas) i ewaluowana pod względem czułości, specyficzności, wyniku F1 i ogólnej dokładności, aby uwzględnić potencjalną nierównowagę klas. Wymagana jest z góry określona minimalna docelowa dokładność 90% dla wdrożenia modelu na pełnym zestawie danych. Miejsca badania i struktura organizacyjna Badanie BOARDING-PASS będzie prowadzone w czterech jednostkach operacyjnych (UO), z których każda ma określone role w celu zapewnienia wysokiej jakości pozyskiwania danych i ustandaryzowanych procedur klinicznych.

      - UO1 (ASST Fatebenefratelli-Sacco, Mediolan) jest ośrodkiem koordynującym, odpowiedzialnym za rekrutację pacjentów i wyjściowe oceny diagnostyczne, ustandaryzowane zbieranie danych klinicznych i biologicznych. Badacze UO1 zapewnią koordynację i nadzór w ramach wieloośrodkowej sieci badawczej, utrzymując skuteczną komunikację między klinicystami, badaczami i personelem technicznym.

      • UO2 (ASST Papa Giovanni XXIII, Bergamo) jest odpowiedzialna za rekrutację uczestników, ocenę diagnostyczną, zbieranie próbek biologicznych, pozyskiwanie danych strukturalnego i stanu spoczynkowego MRI również w imieniu UO1 oraz analizę neuroobrazową strukturalną.
      • UO3 (ASL 2 Lanciano-Vasto-Chieti) będzie prowadzić rekrutację i ocenę uczestników, zbieranie i zarządzanie danymi, zbieranie próbek biologicznych, a także pozyskiwanie danych neuroobrazowych strukturalnych i funkcjonalnych.
      • UO4 (Uniwersytet Teramo) służy jako scentralizowane centrum odpowiedzialne za analizy biologiczne, szczególnie regulację transkrypcji genów i analizy mikrobioty. UO4 jest również odpowiedzialna za analizę danych neuroobrazowych funkcjonalnych oraz za implementację algorytmów ML.