Staging Integrativo del Disturbo Bipolare: Incorporare i Biomarcatori nella Progressione Attraverso gli Stadi (BOARDING-PASS)

Razionale Il Disturbo Bipolare (DB) è una condizione altamente prevalente (circa l'1% nella popolazione generale) e invalidante, caratterizzata da un decorso cronico e progressivo. La storia naturale del DB include tipicamente una fase iniziale asintomatica, seguita da uno stadio prodromico, e successivamente l'esordio di un primo episodio sindromico (depressivo o maniacale), che di solito è seguito da episodi ricorrenti, spesso in assenza di una completa remissione interepisodica. Un crescente corpo di evidenze supporta l'idea che il decorso longitudinale del DB sia associato a un processo attivo di neuroprogressione, caratterizzato da alterazioni cerebrali progressive e compromissione funzionale. Diversi fattori clinici possono influenzare la traiettoria del disturbo, tra cui il numero di episodi affettivi, la presenza di comorbidità psichiatriche e mediche, l'esposizione a eventi di vita stressanti e una storia familiare di disturbi psichiatrici. Gli studi di neuroimaging hanno costantemente supportato l'ipotesi neuroprogressiva nel DB, dimostrando alterazioni cerebrali strutturali e funzionali che emergono progressivamente con l'avanzare della malattia. Anomalie sono state descritte anche a livello delle reti neurali su larga scala. In particolare, la Default Mode Network sembra mostrare pattern alterati di iper- e ipo-connessione con i sistemi affettivi, fronto-parietali e attentivi, coinvolgendo hub chiave responsabili di un'efficiente comunicazione cerebrale su larga scala. Inoltre, alterazioni strutturali e funzionali sono state identificate anche in parenti non affetti di pazienti con DB. Studi che indagano ulteriori biomarcatori nel DB hanno fornito ulteriori prove a supporto di una progressione del disturbo correlata agli stadi, in particolare per quanto riguarda il Fattore Neurotrofico Cerebrale (BDNF) e le citochine infiammatorie. Nel complesso, i recenti progressi nel campo della stadiazione clinica del DB, insieme ai progressi nell'identificazione di marcatori biologici (ad esempio, modulazione della trascrizione genica, segnalazione neurotrofica, vie immuno-infiammatorie, microbiota) e neuroimaging (struttura e funzione dei sistemi cerebrali su larga scala), forniscono una solida base razionale per lo sviluppo di un modello di stadiazione multidimensionale. Un tale modello integrerebbe dati clinici e neurobiologici, consentendo una maggiore precisione diagnostica, prognostica e terapeutica.

Obiettivi specifici e disegno sperimentale

Lo studio BOARDING PASS ha i seguenti obiettivi:

1. valutare longitudinalmente la progressione clinica del DB in un periodo di 18 mesi utilizzando il modello di stadiazione di Kupka & Hillegers;
2. investigare il ruolo di marcatori biologici e di neuroimaging nelle transizioni di stadio del DB (ovvero regolazione della trascrizione genica, infiammazione, microbiota, misure di neuroimaging strutturale e funzionale);
3. implementare un modello predittivo di ML basato sull'integrazione di dati clinici, biologici e di neuroimaging, al fine di fornire una previsione individualizzata e guidata dai dati delle transizioni di stadio del DB.

Lo studio prevede il reclutamento consecutivo di 120 soggetti arruolati in tre dei quattro centri partecipanti: UO1 (ASST Fatebenefratelli-Sacco, Milano), UO2 (ASST Papa Giovanni XXIII, Bergamo) e UO3 (ASL 2 Abruzzo, Lanciano-Vasto-Chieti). I criteri di inclusione ed esclusione sono dettagliati di seguito.

Criteri di inclusione:

1. Soggetti affetti e non affetti da DB il cui stadio clinico rientra in quelli definiti dal modello di Kupka e Hillegers, ovvero:

   stadio 0 (rischio aumentato: avere un parente di primo grado con DB, in assenza di sintomi psichiatrici); stadio 1 (avere un parente di primo grado con DB, in presenza di sintomi psichiatrici aspecifici o episodio(i) depressivo); stadio 2 (primo episodio ipo/maniacale che consente una diagnosi di DB di tipo I o II secondo il DSM-5; APA, 2013); stadio 3 (episodio(i) ricorrenti: depressivo, ipo/maniacale o misto); stadio 4 (disturbo persistente non remittente: episodi depressivi, maniacali o misti cronici, incluso il ciclismo rapido);

2. Individui di entrambi i sessi;
3. Età ≥ 18 anni e ≤ 70 anni;
4. Capacità di fornire un valido consenso informato scritto.

Criteri di esclusione:

1. Incapacità di fornire un valido consenso informato scritto;
2. Presenza di disabilità intellettiva;
3. Presenza di una condizione medica concomitante grave;

4. Presenza di un disturbo da uso di sostanze in atto. Dopo aver fornito il consenso informato scritto alla partecipazione, i soggetti arruolati subiranno una valutazione basale (T0) e poi entreranno in un periodo di follow-up di 18 mesi costituito da tre successivi punti temporali: T1 (6 mesi dopo T0), T2 (12 mesi dopo T0) e T3 (18 mesi dopo T0). A T0 e a ogni successivo punto temporale, la valutazione del partecipante includerà: (i) valutazione clinica e psicometrica; esclusivamente a T0, T2 e T3, (ii) valutazione dei marcatori biologici; e (iii) risonanza magnetica cerebrale per l'acquisizione di dati di risonanza magnetica strutturale e funzionale.

   Valutazione clinica e psicometrica

   Al basale (T0), per ogni partecipante allo studio, le principali variabili sociodemografiche e cliniche saranno raccolte e inserite in un database anonimizzato. Queste includono:

   (a) dati sociodemografici: età, sesso, etnia, livello di istruzione, stato civile e stato occupazionale; (b) caratteristiche cliniche: storia familiare di disturbi psichiatrici, sottotipo di DB, età all'esordio del DB e eventi di vita stressanti associati, durata della malattia, durata della malattia non trattata, età al primo episodio depressivo e ipo/maniacale, polarità del primo e del più recente episodio affettivo, polarità predominante, numero totale di episodi affettivi nell'arco della vita, presenza di caratteristiche miste o di ciclismo rapido, trattamenti psicofarmacologici attuali e precedenti, comorbidità mediche e psichiatriche, storia di disturbo da uso di sostanze, numero di ospedalizzazioni nell'arco della vita e tentativi di suicidio.

   Queste variabili saranno utilizzate per assegnare lo stadio clinico a T0 secondo il modello di Kupka e Hillegers (Kupka & Hillegers, 2012). A ogni successivo punto temporale, i dati sociodemografici e clinici saranno aggiornati per riassegnare lo stadio corrispondente e valutare potenziali associazioni tra variabili cliniche e la probabilità di progressione verso stadi più avanzati della malattia.

   La valutazione clinica includerà inoltre la somministrazione delle seguenti scale e questionari psicometrici: il Test di Intelligenza Breve (TIB; Sartori, 1997; Colombo, 2002), tempo di somministrazione circa 5 minuti; la Hamilton Depression Rating Scale (HDRS-21; Hamilton, 1960; Cassano et al., 1991), tempo di somministrazione circa 20 minuti; la Hamilton Anxiety Rating Scale (HARS; Hamilton, 1959; Cassano et al., 1991), tempo di somministrazione circa 15 minuti; la Montgomery-Åsberg Depression Rating Scale (MADRS; Montgomery & Åsberg, 1979; Palma et al., 1999), tempo di somministrazione circa 15 minuti; la Young Mania Rating Scale (YMRS; Young et al., 1978; Palma et al., 1999), tempo di somministrazione circa 15 minuti; e la Global Assessment of Functioning (GAF; Hall, 1995; APA, 1996), tempo di somministrazione circa 2 minuti; Family Interview for Genetic Studies (FIGS); Drugs Abuse Screening Test (DAST-10), il tempo di somministrazione è stato stimato in circa 5 minuti. Test TWEAK con un tempo di completamento di circa 2 minuti. Childhood Trauma Questionnaire (CTQ), richiede 5-10 minuti e sarà somministrato al basale. Paykel Scale for Recent Life Events, la sua somministrazione richiede circa 15 minuti e sarà condotta al basale; Clinician Rating Scale (CRS), registrata in circa 2 minuti a ogni punto temporale e finalizzata a valutare l'aderenza dei pazienti al trattamento farmacologico.

   Valutazione dei marcatori biologici: Regolazione della trascrizione genica, infiammazione, dati del microbioma

   Campioni biologici per analisi di espressione genica, infiammazione e microbioma saranno raccolti al basale, T2 e T3. Nello specifico:

   1. campioni di saliva non stimolata - ovvero saliva intera raccolta in condizioni di riposo senza stimolazione gustativa, masticatoria o farmacologica - saranno ottenuti utilizzando tamponi buccali di cotone (Salivette, Sarstedt, Nümbrecht, Germania) e conservati a -20 °C fino all'estrazione del DNA genomico (gDNA). Anche gli esosomi saranno isolati dalla saliva e i miRNA purificati utilizzando un kit di isolamento dell'RNA degli esosomi.

   2. campioni di sangue venoso periferico saranno raccolti in due tubi vacutainer da 5 ml contenenti citrato di sodio. Siero e componenti cellulari saranno separati e l'RNA totale così come il gDNA saranno estratti dai PBMC.

      Tutti i campioni biologici raccolti nei tre siti di reclutamento (Unità 1, 2 e 3) saranno trasferiti al laboratorio centrale (Unità 4) per una lavorazione e analisi standardizzate, tra cui:

      - LIPIDOMICA per analizzare gli acidi grassi a catena corta (SCFA) estratti dalla saliva, sarà effettuata la derivatizzazione per l'analisi LC-MS/MS.

      Studi di biologia molecolare:

      - analisi dell'espressione genica. L'abbondanza relativa delle specie di mRNA nei PBMC sarà valutata mediante real-time RT-PCR e Digital PCR.

      - metilazione del DNA sia nelle cellule del sangue che della saliva a. lo stato generale di metilazione del DNA sarà analizzato utilizzando il metodo Reduced representation bisulfite sequencing (RRBS) (sequenziamento SBS della piattaforma SURFseq5000); b. lo studio di metilazione del DNA specifico per gene sarà eseguito su DNA trattato con bisolfito (BS) amplificato e i livelli di metilazione analizzati utilizzando PyroMark Q48 (64).

      - miRNA esosomiali salivari: analisi miRNOme e miRNA selezionati dopo analisi di rete mediante RealTime PCR e Digital PCR.

      • Legame DNA-fattori trascrizionali. Tecnica di saggio ALPHAScreenTM per verificare se gli elementi di riconoscimento identificati al promotore dei geni si legano a diversi fattori trascrizionali e se questo legame è direttamente modulato dal grado di metilazione dei motivi CpG.
      • COMPOSIZIONE del MICROBIOTA salivare mediante sequenziamento del microbioma dell'rRNA 16S.

      Valutazione neuroimaging

      Le valutazioni MRI saranno eseguite utilizzando scanner 3T a T0, T2 e T3, e comprendono:

      - MRI strutturale (sMRI): le immagini pesate in T1 3D saranno acquisite utilizzando una sequenza SPGR (TE = minimo (full); angolo di flip, 6°; FOV, 250 mm; bandwidth, 31.25; matrice, 256 x 256) con 124 slice assiali di spessore 1,3 mm. In seguito alla ricostruzione della superficie corticale, gli indici di gireficazione locale saranno calcolati per 68 regioni corticali parcellizzate basate sull'Atlante di Desikan utilizzando FreeSurfer v7.1.0. Una procedura di stima del bias jackknife sarà quindi applicata per determinare il contributo di ciascun individuo alla struttura di covarianza a livello di gruppo, generando una matrice di distanza individuale 68×68. L'organizzazione topologica delle reti di covarianza strutturale risultanti sarà successivamente analizzata utilizzando il Graph Analysis Toolbox.

      - Risonanza magnetica funzionale a riposo: le immagini rs-fMRI saranno acquisite utilizzando una sequenza EPI gradient-echo con 36 slice assiali (TE = 30 ms; TR = 2000 ms; dimensione voxel: 3×3×4 mm3; dimensione matrice: 64×64; FOV: 192×192 mm2);, acquisite in ordine interlacciato. Ogni sessione a riposo consisterà di 400 volumi. La pre-elaborazione sarà condotta utilizzando una combinazione di FMRIB's Software Library (FSL) e script MATLAB personalizzati. La pipeline includerà i seguenti passaggi: (1) riorientamento nello spazio standard; (2) rilevamento di volumi anomali, seguito da interpolazione basata su spline dei punti temporali anomali; (3) pre-elaborazione spaziale e temporale, inclusa correzione del movimento (MCFLIRT), filtraggio passa-alto temporale e smoothing spaziale (FWHM = 5 mm); (4) estrazione del cervello dall'immagine strutturale; (5) registrazione non lineare allo spazio standard MNI152 utilizzando FSL-FNIRT. I connessomi funzionali statici e dinamici saranno stimati calcolando i coefficienti di correlazione di Pearson trasformati in z tra tutte le coppie di regioni cerebrali nello schema di parcellazione adottato. La connettività dinamica sarà calcolata utilizzando un approccio a finestra scorrevole con una lunghezza della finestra di 30 TR e una dimensione del passo di 2 TR. Questi passaggi saranno implementati tramite software interno sviluppato in MATLAB. Le misure di teoria dei grafi saranno calcolate tramite il Brain Connectivity Toolbox (MATLAB).

      Per minimizzare la variabilità inter-sito nei dati di neuroimaging, sia le acquisizioni MRI strutturali che funzionali saranno eseguite utilizzando protocolli armonizzati nei due centri di imaging, ciascuno dotato di uno scanner 3 T. Algoritmi ML Un framework ML sarà sviluppato per prevedere le transizioni di stadio clinico nel DB integrando i dati clinici, biologici e di neuroimaging raccolti. Per gestire l'integrazione di dati multimodali, adotteremo pipeline di pre-elaborazione robuste che includono normalizzazione dei dati, rilevamento di outlier e metodi di imputazione per gestire valori mancanti (ad esempio, k-nearest neighbor o imputazione multipla). Le analisi ML inizieranno al mese 6 dello studio e saranno condotte utilizzando il Statistics and Machine Learning Toolbox di MATLAB, inizialmente supportate dal software NeuroMiner (http://proniapredictors.eu/neurominer/index.html), una piattaforma software validata progettata per gestire dataset eterogenei. NeuroMiner fornisce un'ampia gamma di framework di cross-validation, strategie di pre-elaborazione, algoritmi di apprendimento supervisionato, strumenti di selezione delle caratteristiche e metodi di validazione esterna. L'approccio ML sarà basato su classificatori supervisionati, principalmente Support Vector Machine (SVM) e modelli bayesiani. Nella fase preliminare, i classificatori saranno addestrati e testati su dataset preliminari per confrontare modelli predittivi alternativi in un ambiente controllato e identificare la configurazione algoritmica con le migliori prestazioni. Successivamente, procedure di selezione delle caratteristiche saranno impiegate per identificare le variabili più discriminative dal pool di caratteristiche candidate. Questo passaggio è cruciale per migliorare l'interpretabilità del modello e prevenire l'overfitting, specialmente in dataset di piccole dimensioni e ad alta dimensionalità tipici degli studi multimodali. Infatti, riducendo il numero di variabili di input, la selezione delle caratteristiche minimizza il rumore, riduce la complessità del modello e migliora la generalizzabilità delle previsioni ML. Se necessario (ovvero se la dimensionalità dello spazio delle caratteristiche è ancora troppo alta), per ridurre ulteriormente l'overfitting e il carico computazionale, potrebbe essere applicata l'Analisi delle Componenti Principali. I classificatori SVM saranno prioritari per la loro robustezza nella gestione di dati ad alta dimensionalità e piccoli campioni. Inoltre, sarà applicata una ponderazione delle classi in modo che gli errori sugli stadi minoritari siano penalizzati più pesantemente, riducendo il bias introdotto da dimensioni di gruppo disuguali. Le prestazioni del modello saranno valutate utilizzando tecniche di cross-validation (ad esempio leave-one-out o stratified k-fold, a seconda della struttura dei dati e della distribuzione delle classi) e valutate in termini di sensibilità, specificità, punteggio F1 e accuratezza complessiva, per tenere conto del potenziale squilibrio delle classi. È richiesta una accuratezza minima target predefinita del 90% per il dispiegamento del modello sul dataset completo. Siti di studio e struttura organizzativa Lo studio BOARDING-PASS sarà condotto in quattro unità operative (UO), ciascuna con ruoli definiti per garantire un'acquisizione di dati di alta qualità e procedure cliniche standardizzate.

      - UO1 (ASST Fatebenefratelli-Sacco, Milano) è il centro coordinatore, responsabile del reclutamento dei pazienti e delle valutazioni diagnostiche basali, raccolta standardizzata di dati clinici e biologici. Gli investigatori di UO1 forniranno coordinamento e supervisione all'interno della rete di ricerca multicentrica, mantenendo una comunicazione efficace tra clinici, ricercatori e personale tecnico.

      • UO2 (ASST Papa Giovanni XXIII, Bergamo) è responsabile del reclutamento dei partecipanti, della valutazione diagnostica, della raccolta di campioni biologici, dell'acquisizione di dati MRI strutturali e a riposo anche per conto di UO1, e dell'analisi neuroimaging strutturale.
      • UO3 (ASL 2 Lanciano-Vasto-Chieti) condurrà il reclutamento e la valutazione dei partecipanti, la raccolta e gestione dei dati, la raccolta di campioni biologici, nonché l'acquisizione di dati neuroimaging strutturali e funzionali.
      • UO4 (Università di Teramo) funge da struttura centralizzata responsabile delle analisi biologiche, in particolare della regolazione della trascrizione genica e delle analisi del microbiota. UO4 è anche responsabile dell'analisi dei dati di neuroimaging funzionale e dell'implementazione degli algoritmi ML.