Vliv terapií snižujících hladinu glukózy na cirkulující endoteliální progenitorové buňky a jejich mobilizační faktor Stromální derivovaný faktor-1α u pacientů s diabetem 2. typu (IGLOOS)

Cukrovka je chronické onemocnění, které v roce 2011 celosvětově postihuje 366 milionů lidí a odhaduje se, že do roku 2030 celosvětově vzroste na 552 milionů, tedy jednoho z 10 dospělých. Jen ve Spojeném království je prevalence 4,5 % a předpokládá se, že v roce 2025 bude postiženo přibližně 5 milionů lidí. Z celé populace lidí s diabetem tvoří diabetes mellitus 2. typu (T2DM) více než 90 %. Ve Spojeném království Prospective Diabetes Study (UKPDS) mělo 50 % lidí s T2DM v době diagnózy mikro a/nebo makrovaskulární komplikace. Je dobře známo, že lidé s T2DM mají také 4 až 5krát vyšší riziko kardiovaskulárních komplikací ve srovnání s běžnou populací, což představuje 80 % mortality. Zátěž diabetu as ním spojených komplikací na zdravotnické služby je tedy obrovská. Samotné předepisování léků na komplikace spojené s diabetem stojí 3 až 4krát více než náklady na léky na zvládání diabetu v Národní zdravotní službě (NHS). Jsou tedy žádoucí terapie, které se současně zaměřují na glykemickou kontrolu a diabetické komplikace, zejména kardiovaskulární onemocnění (CVD), nezávisle na jejich účinku na snižování glukózy.

Současná studie si klade za cíl zhodnotit terapeutické účinky terapií na bázi inkretinů (inhibitory DPP-4 versus analogy GLP-1) a terapií na bázi inkretinů oproti léčbě bez inkretinů na hladinách EPC, SDF-1α a dalších biomarkerů u pacientů s T2DM. na těchto léčbách (příjem po dobu > 3 měsíců).

Cíle studie Zjistit, zda je léčba inhibitory DPP-4 u pacientů s T2DM spojena se zvýšenými hladinami endoteliálních progenitorových buněk (EPC) a stromálního odvozeného faktoru-1 α (SDF-1α) ve srovnání s těmi, kteří dostávají analogy GLP-1 v křížovém sekční analýza upravená pro zmatky.

Dále si studie klade za cíl určit, zda je léčba inkretinovými terapiemi spojena s vyššími hladinami EPC a SDF1-α v oběhu ve srovnání s neinkretinovými terapiemi.

Příprava mononukleárních buněk periferní krve (PBMC) pro následnou kvantifikaci EPC PBMC budou odebrány za použití standardních technik. Stručně řečeno, PBMC budou izolovány z venózní krve odebrané do 9,7ml krevní zkumavky s heparinem sodným (která bude následně skladována při pokojové teplotě po dobu až 4 hodin). Vzorky krve budou poté odstředěny (1500 g po dobu 10 minut při 4 °C) a vrstva plazmy bude odebrána pro pozdější analýzu biomarkerů (alikvoty plazmy budou zmraženy při -80 °C až do použití). Vrstva buffy coat (bílá neprůhledná vrstva, která leží přímo nad peletou červených krvinek) bude použita pro izolaci PBMC. K izolaci PBMC se buffy coat odstředí při 400 g na gradientu Ficoll (1,077 g/ml) po dobu 30 minut a výsledná buněčná vrstva se poté podrobí 3 dalším promytím (300 g po dobu 10 minut a 20 g po dobu 10 minut X2). promyjte buňky a zbavte krevních destiček. Pro výpočet počtu izolovaných PBMC se peleta suspenduje ve známém objemu fosfátem pufrovaného roztoku (PBS) (1 ml) a u malého množství (10 µl) se vyhodnotí množství a životaschopnost pod inverzním mikroskopem za použití hemocytometru a vitální skvrna (trypanová modř).

Aby se zabránilo kolísání mezi testy v důsledku podélného odběru vzorků, vzorky budou uchovávány v parách kapalného dusíku (za použití standardních protokolů zmrazování) a kvantifikace EPC bude provedena jako jedna dávka na skladovaných vzorcích.

Kvantifikace EPC EPC budou kvantifikovány jako buňky vykazující dvojí pozitivitu pro buněčný povrch / transmembránové markery: klastr diferenciace 24 (CD24) a receptor kinázové domény (KDR). Budou použity standardizované protokoly průtokové cytometrie. Stručně řečeno, buňky budou rozmraženy a imunofluorescenční barvení buněk bude provedeno pomocí fluorescenčních konjugovaných protilátek: CD34-fluorescein isothiokyanát (FITC) a KDR-fykoerythrin (PE). Pro každého pacienta bude zpracována odpovídající negativní kontrola s IgG2a-FITC-PE. Počet cirkulujících EPC bude vyjádřen jako celkový počet buněk vykazujících dvojí pozitivitu pro CD24 a KDR na ul původně zpracované krve.

Biomarkery Analýza SDF-1α a analýza biomarkerů spojených s prevalencí cirkulujících EPC budou měřeny pomocí sendvičové ELISA a technologie multi-array ELISA v souladu s protokoly výrobce. Analýza endogenního DPP4 bude testována za použití komerčního kolorimetrického testu; opět budou dodržovány protokoly výrobce. Analýza biomarkerů a DPP4 bude provedena v jedné dávce na skladovaných vzorcích plazmy heparinu sodného.

Statistika Statistické metody a analýza Základní charakteristiky budou zobrazeny podle skupin (ti, kteří v současné době dostávají inhibitor DPP-4, ti, kteří aktuálně dostávají analog GLP-1 a ti, kteří v současné době neužívají inhibitor DPP-4 nebo analog GLP-1) jako průměr a standardní odchylka pro normální distribuované spojité proměnné, medián a interkvartilní rozsah pro nenormálně distribuované spojité proměnné a počty a procenta pro kategorické proměnné. Primární výsledek (EPC) bude porovnán podle léčebné skupiny pomocí lineární regrese, s a bez úpravy pro potenciální zmatky. Mezi faktory, které je třeba vzít v úvahu, patří věk, pohlaví, etnická příslušnost, index tělesné hmotnosti, trvání T2DM a léčba inzulínem. Bude uveden průměrný EPC a jeho 95% interval spolehlivosti v každé ze tří skupin, stejně jako průměrný rozdíl mezi léčebnou skupinou DPP-IV vs. GLP-1 a mezi inkretinovými vs neinkretinovými léčebnými skupinami. Podobná analýza bude použita pro všechny průběžné sekundární výstupy. Binární výsledky budou porovnány podle skupin pomocí logistické regresní analýzy s a bez úpravy pro stejné zmatky. Všechny statistické testy budou 2stranné a p<0,05 bude považováno za statisticky významné.

Velikost vzorku Na základě síly 80 % a významnosti 0,025 (aby bylo možné provést dvě primární srovnání, tj. Uživatelé DPP-IV vs. uživatelé GLP-1 a uživatelé inkretinů vs. uživatelé bez inkretinů) bude muset 216 pacientů (72 v každé ze tří skupin) detekovat rozdíl 10 EPC/μl za předpokladu SD 19,2 k síle 24. Tato velikost vzorku také umožní detekovat rozdíl 8 pg/ml SDF-la se 75% výkonem za předpokladu SD 16 až 24.

Správa dat Správa sběrných listů Všechna klinická data budou uložena v zabezpečené oblasti v Leicester Diabetes Centre. Každému zapsanému předmětu bude přiděleno jedinečné studijní identifikační číslo (ID), aby elektronická databáze zůstala anonymní.

Formulář pro sběr dat (Case report Form, CRF) je primárním nástrojem sběru dat. Proběhne kontrola správy dat a tam, kde to bude možné, budou chybějící data vysvětlena. Pokud se položka na jednotlivý případ nevztahuje, zapíše se N/A. Všechny záznamy budou vytištěny čitelně černým inkoustem. Pokud došlo k jakékoli chybě při zadávání, bude pro opravu chyby prokreslena jedna čára přes nesprávné zadání a správné údaje zadané nad ním. Všechny takové změny budou parafovány a opatřeny datem. Pro objasnění nečitelných nebo nejistých záznamů bude vysvětlení vytištěno nad položkou a toto bude parafováno a datováno.

Uchovávání dokumentace, přístup, zabezpečení, archivace Veškerá dokumentace studie obsahující identifikovatelné údaje o pacientech bude spravována v souladu s Mezinárodní konferencí o harmonizaci a správné klinické praxi (ICH-GCP), Rámcem pro řízení výzkumu pro zdravotní a sociální péči a zákonem o ochraně údajů. Informace budou od pacienta získány pouze v případě, že to bude nutné pro studii.

Všechna elektronická data budou uložena na zabezpečených univerzitních (University of Leicester) nebo nemocničních (University Hospitals of Leicester NHS Trust) síťových discích, ke kterým má přístup pouze příslušný studijní personál, což je uděleno výzkumným týmem.

Všechny studijní dokumenty a údaje budou uchovávány po dobu 5 let nebo minimálně po dobu stanovenou regulačními orgány, podle toho, která doba je delší. Soubor studie bude archivován v souladu se zásadami důvěry.

Důvěrnost údajů Každému účastníkovi bude při náboru přiděleno jedinečné identifikační číslo. Kontaktní údaje pacientů budou uchovávány v samostatné databázi a použity k uspořádání studijních návštěv. Databáze bude chráněna heslem a přístup budou mít pouze členové výzkumného týmu, kteří kontaktují pacienty. Všechna data shromážděná během studie budou anonymně uložena v samostatné databázi. Přístup bude opět chráněn heslem a bude omezen na příslušné členy výzkumného týmu. Elektronická data budou uložena v systému univerzity nebo NHS.

Bezpečnostní otázky Zkoušející nepředpokládají žádné nežádoucí příhody nad rámec těch, které jsou spojeny s každodenním životem a rutinní zdravotní péčí, které by bylo možné přičíst studii. Studie zahrnuje pouze jednu venepunkci k odběru žilní krve, a proto s sebou nese velmi nízké riziko nežádoucích účinků. Všichni účastníci však podstoupí venepunkci, která může příležitostně způsobit modřiny, otoky a dočasné nepohodlí.

Vyšetřovatelé se budou řídit pokyny University of Leicester pro řízení a hlášení závažných nežádoucích příhod (SAE) nebo Suspected Unexpected Serious Adverse Reaction (SUSAR), které se řídí pokyny uvedenými v pokynech pro správnou klinickou praxi (GCP).

SAE je jakákoli nežádoucí příhoda nebo neočekávaná nežádoucí reakce, která má za následek smrt ohrožující život, vyžaduje hospitalizaci nebo prodloužení stávající hospitalizace má za následek přetrvávající nebo významnou invaliditu nebo nezpůsobilost sestává z vrozené anomálie nebo vrozené vady. Kromě toho vyšetřovatelé také definují událost jako závažnou, pokud se jedná o důležitou a významnou zdravotní událost, která nemusí bezprostředně ohrožovat život nebo vést k úmrtí nebo hospitalizaci, ale na základě příslušného lékařského posouzení může ohrozit pacienta nebo může vyžadovat zásah zabránit jednomu nebo více výše uvedeným výsledkům. Nežádoucí účinky, které nespadají do těchto kategorií, jsou definovány jako nezávažné.

Všechny SAE budou interně hlášeny univerzitním nemocnicím v Leicesteru (UHL), NHS Trust Research & Development (R&D) a sponzorovi (University of Leicester) pomocí vhodných formulářů pro hlášení, a to do 24 hodin poté, co se studijní tým o události dozvěděl. Hlavní zkoušející je odpovědný za přezkoumání a předložení jakýchkoli SAE, nebo v jejich nepřítomnosti jiného člena týmu (aby se předešlo prodlení). Soubor vyšetřujícího místa bude obsahovat dokumentaci pro zprávy o SAE a důkazy o včasném podání.