Wpływ terapii obniżających poziom glukozy na krążące komórki progenitorowe śródbłonka i jego czynnik mobilizujący Czynnik-1α pochodzenia zrębowego u pacjentów z cukrzycą typu 2 (IGLOOS)

Cukrzyca jest chorobą przewlekłą, która w 2011 roku dotykała 366 milionów ludzi na całym świecie i szacuje się, że do 2030 roku liczba ta wzrośnie do 552 milionów na całym świecie, czyli jednej na 10 osób dorosłych. W samej Wielkiej Brytanii rozpowszechnienie wynosi 4,5%, a przewiduje się, że w 2025 r. dotknie to około 5 milionów ludzi. Spośród całej populacji osób z cukrzycą, cukrzyca typu 2 (T2DM) stanowi ponad 90%. W badaniu przeprowadzonym w Wielkiej Brytanii Prospective Diabetes Study (UKPDS) u 50% osób z cukrzycą typu 2 w momencie rozpoznania wystąpiły powikłania mikro- i/lub makronaczyniowe. Powszechnie wiadomo, że osoby z cukrzycą typu 2 mają również 4 do 5 razy większe ryzyko powikłań sercowo-naczyniowych w porównaniu z populacją ogólną, co odpowiada za 80% śmiertelności. Tym samym obciążenie opieki zdrowotnej związane z cukrzycą i związanymi z nią powikłaniami jest ogromne. Przepisywanie leków na powikłania związane z samą cukrzycą kosztuje 3 do 4 razy więcej niż koszt leków na cukrzycę w National Health Service (NHS). Tak więc pożądane są terapie, które jednocześnie celują w kontrolę glikemii i powikłania cukrzycowe, zwłaszcza chorobę sercowo-naczyniową (CVD), niezależnie od ich działania obniżającego poziom glukozy.

Obecne badanie ma na celu ocenę efektów terapeutycznych terapii opartych na inkretynach (inhibitory DPP-4 w porównaniu z analogami GLP-1) i terapii opartych na inkretynach w porównaniu z terapiami opartymi na inkretynach na poziomy EPC, SDF-1α i innych biomarkerów u pacjentów z T2DM ustalonym na tych zabiegach (otrzymywanie przez >3 miesiące).

Cele badania Zbadanie, czy leczenie inhibitorami DPP-4 u pacjentów z cukrzycą typu 2 wiąże się ze zwiększonym poziomem komórek progenitorowych śródbłonka (EPC) i czynnika 1 α pochodzenia zrębowego (SDF-1 α) w porównaniu z pacjentami otrzymującymi analogi GLP-1 w badaniu krzyżowym analiza przekrojowa skorygowana o czynniki zakłócające.

Ponadto badanie ma na celu ustalenie, czy leczenie terapiami opartymi na inkretynach wiąże się z wyższymi poziomami EPC i SDF1-α w krążeniu w porównaniu z terapiami nie opartymi na inkretynach.

Przygotowanie jednojądrzastych komórek krwi obwodowej (PBMC) do późniejszej oceny ilościowej EPC PBMC zostaną zebrane przy użyciu standardowych technik. W skrócie, PBMC zostaną wyizolowane z krwi żylnej pobranej do probówki z heparyną sodową o pojemności 9,7 ml (która będzie następnie przechowywana w temperaturze pokojowej przez maksymalnie 4 godziny). Próbki krwi zostaną następnie odwirowane (1500 g przez 10 min w 4⁰C) i pobrana zostanie warstwa osocza do późniejszej analizy biomarkerów (porcje osocza zostaną zamrożone w temperaturze -80⁰C do momentu użycia). Warstwa kożuszka leukocytarnego (biała nieprzezroczysta warstwa znajdująca się bezpośrednio nad osadem krwinek czerwonych) zostanie użyta do izolacji PBMC. Aby wyizolować PBMC, kożuszek leukocytarny będzie wirowany przy 400 g na gradiencie Ficoll (1,077 g/ml) przez 30 minut, a następnie uzyskana warstwa komórkowa zostanie poddana 3 kolejnym przemywaniom (300 g przez 10 minut i 20 g przez 10 minut X2) w celu wyizolowania PBMC. przemyć komórki i zubożyć płytki krwi. Aby obliczyć liczbę wyizolowanych PBMC, osad zostanie zawieszony w znanej objętości roztworu buforowanego fosforanami (PBS) (1 ml), a niewielka ilość (10 µl) zostanie oceniona pod względem ilości i żywotności pod mikroskopem odwróconym przy użyciu hemocytometru i barwnik witalny (błękit trypanu).

Aby zapobiec zmienności między testami spowodowanej podłużnym pobieraniem próbek, próbki będą przechowywane w parach ciekłego azotu (przy użyciu standardowych protokołów zamrażania), a oznaczenie ilościowe EPC zostanie przeprowadzone jako jedna partia przechowywanych próbek.

Kwantyfikacja EPC EPC będą oznaczane ilościowo jako komórki wykazujące podwójną pozytywność dla markerów powierzchniowych / transbłonowych: Cluster of Differentiation 24 (CD24) i Receptor Domeny Kinazowej (KDR). Zastosowane zostaną standaryzowane protokoły cytometrii przepływowej. W skrócie, komórki zostaną rozmrożone i przeprowadzone zostanie barwienie immunofluorescencyjne przy użyciu skoniugowanych przeciwciał fluorescencyjnych: CD34-izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC) i KDR-fikoerytryny (PE). Dla każdego pacjenta zostanie przetworzona odpowiednia kontrola negatywna z IgG2a-FITC-PE. Liczba krążących EPC zostanie wyrażona jako całkowita liczba komórek wykazujących podwójną dodatniość dla CD24 i KDR na µl pierwotnie przetworzonej krwi.

Biomarkery Analiza SDF-1α i analiza biomarkerów związanych z występowaniem krążących EPC będą mierzone przy użyciu technologii kanapkowej ELISA i wielomacierzowej technologii ELISA zgodnie z protokołami producenta. Analiza endogennego DPP4 zostanie przeprowadzona przy użyciu komercyjnego testu kolorymetrycznego; ponownie będą przestrzegane protokoły producenta. Analiza biomarkerów i DPP4 zostanie przeprowadzona w jednej partii na przechowywanych próbkach osocza heparyny sodowej.

Statystyki Metody i analizy statystyczne Charakterystyka wyjściowa zostanie wyświetlona według grup (osoby obecnie otrzymujące inhibitor DPP-4, osoby obecnie otrzymujące analog GLP-1 oraz osoby niestosujące obecnie inhibitora DPP-4 lub analogu GLP-1) jako średnia i odchylenie standardowe dla zmienne ciągłe o rozkładzie, mediana i rozstęp międzykwartylowy dla zmiennych ciągłych o rozkładzie innym niż normalny oraz liczebności i procenty dla zmiennych kategorycznych. Pierwotny wynik (EPC) zostanie porównany według grup terapeutycznych przy użyciu regresji liniowej, z korektą i bez uwzględnienia potencjalnych czynników zakłócających. Czynnikami zakłócającymi, które należy wziąć pod uwagę, są wiek, płeć, pochodzenie etniczne, wskaźnik masy ciała, czas trwania cukrzycy typu 2 i leczenie insuliną. Przedstawiona zostanie średnia EPC i jej 95% przedział ufności w każdej z trzech grup, jak również średnia różnica między grupą leczoną DPP-IV a grupą leczoną GLP-1 oraz między grupami leczonymi inkretyną a nieinkretyną. Podobna analiza zostanie zastosowana dla wszystkich ciągłych drugorzędnych wyników. Wyniki binarne zostaną porównane przez grupy przy użyciu analizy regresji logistycznej zi bez korekty dla tych samych czynników zakłócających. Wszystkie testy statystyczne będą dwustronne, a p<0,05 zostanie uznane za istotne statystycznie.

Wielkość próby W oparciu o moc 80% i istotność na poziomie 0,025 (aby umożliwić dwa podstawowe porównania, tj. DPP-IV vs użytkownicy GLP-1 i użytkownicy inkretyn vs użytkownicy nieinkretyni), 216 pacjentów (72 w każdej z trzech grup) będzie potrzebnych do wykrycia różnicy 10 EPC/μl przy założeniu SD 19,2 do potęgi 24. Ta wielkość próbki pozwoli również na wykrycie różnicy 8 pg/ml SDF-1α z mocą 75% przy założeniu SD 16 do potęgi 24.

Zarządzanie danymi Zarządzanie arkuszem zbierania danych Wszystkie dane kliniczne będą przechowywane w bezpiecznym miejscu w Leicester Diabetes Centre. Każdemu zarejestrowanemu pacjentowi zostanie przydzielony niepowtarzalny numer identyfikacyjny badania (ID), dzięki czemu elektroniczna baza danych pozostanie anonimowa.

Formularz zbierania danych (formularz opisu przypadku, CRF) jest podstawowym instrumentem gromadzenia danych. Przeprowadzona zostanie kontrola zarządzania danymi, a brakujące dane zostaną wyjaśnione w miarę możliwości. Jeśli pozycja nie ma zastosowania w indywidualnym przypadku, zostanie napisane N/A. Wszystkie wpisy zostaną wydrukowane czytelnie czarnym atramentem. W przypadku popełnienia błędu przy wpisywaniu, w celu poprawienia błędu, błędny wpis i poprawne dane wprowadzone powyżej zostaną przekreślone pojedynczą linią. Wszystkie takie zmiany będą parafowane i datowane. W celu wyjaśnienia nieczytelnych lub niepewnych wpisów, wyjaśnienie zostanie wydrukowane nad pozycją, parafowane i opatrzone datą.

Przechowywanie dokumentacji, dostęp, bezpieczeństwo, archiwizacja Cała dokumentacja badania zawierająca dane pacjenta umożliwiające identyfikację będzie zarządzana zgodnie z Międzynarodową konferencją na temat harmonizacji - Dobrej Praktyki Klinicznej (ICH-GCP), Ramami Zarządzania Badaniami dla Zdrowia i Opieki Społecznej oraz Ustawą o ochronie danych. Informacje będą uzyskiwane od pacjenta tylko wtedy, gdy będzie to konieczne do badania.

Wszystkie dane elektroniczne będą przechowywane na bezpiecznych dyskach sieciowych uniwersytetów (University of Leicester) lub szpitali (University Hospitals of Leicester NHS Trust), do których dostęp ma tylko odpowiedni personel badawczy, na co zezwala zespół badawczy.

Wszystkie dokumenty i dane dotyczące badań będą przechowywane przez 5 lat lub przez minimum określone przez organy regulacyjne, w zależności od tego, który okres jest dłuższy. Plik badania zostanie zarchiwizowany zgodnie z Polityką zaufania.

Poufność danych Każdemu uczestnikowi przy rekrutacji zostanie nadany unikalny numer identyfikacyjny. Dane kontaktowe pacjentów będą przechowywane w odrębnej bazie danych i wykorzystywane do umawiania wizyt studyjnych. Baza danych będzie chroniona hasłem, a dostęp do niej będą mieli tylko członkowie zespołu badawczego kontaktujący się z pacjentami. Wszystkie dane zebrane podczas badania będą przechowywane anonimowo w oddzielnej bazie danych. Ponownie dostęp będzie chroniony hasłem i ograniczony do odpowiednich członków zespołu badawczego. Dane elektroniczne będą przechowywane w systemie Uczelni lub NFZ.

Kwestie bezpieczeństwa Badacze nie przewidują żadnych zdarzeń niepożądanych wykraczających poza te związane z życiem codziennym i rutynową opieką zdrowotną, które można by przypisać badaniu. Badanie obejmuje tylko jedno nakłucie żyły w celu pobrania krwi żylnej, a zatem wiąże się z bardzo niskim ryzykiem wystąpienia niepożądanych skutków. Jednak wszyscy uczestnicy zostaną poddani nakłuciu żyły, co czasami może skutkować siniakami, obrzękiem i przejściowym dyskomfortem.

Badacze będą postępować zgodnie z wytycznymi Uniwersytetu w Leicester dotyczącymi zarządzania i zgłaszania poważnych zdarzeń niepożądanych (SAE) lub podejrzewanych nieoczekiwanych poważnych działań niepożądanych (SUSAR), które są zgodne z wytycznymi zawartymi w wytycznych dobrej praktyki klinicznej (GCP).

SAE to każde zdarzenie niepożądane lub nieoczekiwana reakcja niepożądana, które skutkują śmiercią, zagrażają życiu, wymagają hospitalizacji lub przedłużenia istniejącej hospitalizacji, skutkują trwałym lub znacznym kalectwem lub niezdolnością do pracy w postaci wady wrodzonej lub wady wrodzonej. Ponadto Badacze zdefiniują również zdarzenie jako poważne, jeśli jest to ważne i znaczące zdarzenie medyczne, które może nie zagrażać bezpośrednio życiu ani nie prowadzić do zgonu lub hospitalizacji, ale w oparciu o odpowiednią ocenę medyczną może zagrażać pacjentowi lub może wymagać interwencji w celu zapobiegać jednemu lub więcej skutkom wymienionym powyżej. Zdarzenia niepożądane, które nie mieszczą się w tych kategoriach, są określane jako niepoważne.

Wszystkie SAE będą zgłaszane wewnętrznie do University Hospitals of Leicester (UHL), NHS Trust Research & Development (R&D) oraz sponsora (University of Leicester) za pomocą odpowiednich formularzy zgłoszeniowych, w ciągu 24 godzin od poinformowania zespołu badawczego o zdarzeniu. Główny badacz jest odpowiedzialny za przegląd i przedłożenie wszelkich SAE lub, w przypadku ich nieobecności, innego członka zespołu (w celu uniknięcia opóźnień). Plik ośrodka badacza będzie zawierał dokumentację raportów SAE i dowody terminowego składania wniosków.