De impact van glucoseverlagende therapieën op circulerende endotheliale progenitorcellen en de mobiliserende factor van stromaal afgeleide factor-1α bij patiënten met diabetes type 2 (IGLOOS)

Diabetes is een chronische aandoening die naar verluidt in 2011 wereldwijd 366 miljoen mensen treft en die in 2030 wereldwijd naar schatting zal zijn gestegen tot 552 miljoen, d.w.z. één op de tien volwassenen. Alleen al in het VK is de prevalentie 4,5% en zullen naar verwachting in 2025 ongeveer 5 miljoen mensen worden getroffen. Van de gehele bevolking van mensen met diabetes vormt Type 2 Diabetes Mellitus (T2DM) meer dan 90%. In de Prospective Diabetes Study (UKPDS) in het Verenigd Koninkrijk vertoonde 50% van de mensen met T2DM micro- en/of macrovasculaire complicaties op het moment van diagnose. Het is algemeen bekend dat mensen met T2DM ook 4 tot 5 keer meer risico lopen op cardiovasculaire complicaties in vergelijking met de algemene bevolking, goed voor 80% van de mortaliteit. De last van diabetes en de bijbehorende complicaties voor de gezondheidszorg is dus enorm. Alleen al het voorschrijven van medicijnen voor de complicaties die verband houden met diabetes kost 3 tot 4 keer meer dan de kosten van medicijnen voor het beheersen van diabetes in de National Health Service (NHS). Aldus zijn therapieën die gelijktijdig gericht zijn op glykemische controle en diabetische complicaties, in het bijzonder hart- en vaatziekten (HVZ), onafhankelijk van hun glucoseverlagende effect, wenselijk.

De huidige studie heeft tot doel de therapeutische effecten te evalueren van op incretine gebaseerde therapieën (DPP-4-remmers versus GLP-1-analogen) en op incretine gebaseerde therapieën versus niet op incretine gebaseerde behandelingen op niveaus van EPC's, SDF-1α en andere biomarkers bij patiënten met vastgestelde T2DM op deze behandelingen (behandeling gedurende >3 maanden).

Doelstellingen van het onderzoek Onderzoeken of behandeling met DPP-4-remmers bij patiënten met T2DM gepaard gaat met verhoogde niveaus van endotheliale progenitorcellen (EPC's) en stromale afgeleide factor-1 α (SDF-1α) in vergelijking met patiënten die GLP-1-analogen in een gekruiste sectionele analyse gecorrigeerd voor confounders.

Verder heeft de studie tot doel vast te stellen of behandeling met op incretine gebaseerde therapieën geassocieerd is met hogere circulerende niveaus van EPC en SDF1-α in vergelijking met niet op incretine gebaseerde therapieën.

Bereiding van perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC's) voor daaropvolgende EPC-kwantificatie. PBMC's zullen worden verzameld met behulp van standaardtechnieken. In het kort zullen PBMC's worden geïsoleerd uit veneus bloed dat is verzameld in een 9,7 ml natriumheparine bloedbuisje (dat vervolgens maximaal 4 uur bij kamertemperatuur zal worden bewaard). De bloedmonsters worden vervolgens gecentrifugeerd (1500 g gedurende 10 min bij 4⁰C) en de plasmalaag wordt verzameld voor latere biomarkeranalyse (monsters plasma worden tot gebruik ingevroren bij -80⁰C). De buffy coat-laag (de witte ondoorzichtige laag die direct boven de rode bloedcelpellet ligt) wordt gebruikt voor PBMC-isolatie. Om de PBMC's te isoleren, wordt de buffy coat 30 minuten gecentrifugeerd bij 400 g op een Ficoll-gradiënt (1,077 g/ml) en de resulterende cellulaire laag wordt vervolgens nog 3 keer gewassen (300 g gedurende 10 minuten en 20 g gedurende 10 minuten X2) om was de cellen en put bloedplaatjes uit. Om het aantal geïsoleerde PBMC's te berekenen, wordt de pellet gesuspendeerd in een bekend volume fosfaatgebufferde oplossing (PBS) (1 ml) en wordt een kleine hoeveelheid (10 µl) beoordeeld op kwantiteit en levensvatbaarheid onder een omgekeerde microscoop met behulp van een hemocytometer en een vitale vlek (trypaanblauw).

Om interassayvariatie als gevolg van longitudinale monsterverzameling te voorkomen, worden de monsters opgeslagen in vloeibare stikstofdamp (met behulp van standaard invriesprotocollen) en wordt kwantificering van de EPC's uitgevoerd als één batch op de opgeslagen monsters.

Kwantificering van EPC EPC's zullen worden gekwantificeerd als cellen die dubbele positiviteit vertonen voor het celoppervlak/transmembraanmarkers: Cluster of Differentiation 24 (CD24) en Kinase Domain Receptor (KDR). Er zullen gestandaardiseerde flowcytometrieprotocollen worden gebruikt. Kortom, de cellen worden ontdooid en immunofluorescente celkleuring wordt uitgevoerd met behulp van de fluorescerende geconjugeerde antilichamen: CD34-fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC) en KDR-fycoerythrine (PE). Voor elke patiënt wordt een overeenkomstige negatieve controle met IgG2a-FITC-PE verwerkt. Het aantal circulerende EPC's zal worden uitgedrukt in termen van het totale aantal cellen dat dubbele positiviteit vertoont voor CD24 en KDR per µl oorspronkelijk verwerkt bloed.

Biomarkers SDF-1α-analyse en de analyse van biomarkers geassocieerd met de prevalentie van circulerende EPC's zullen worden gemeten met behulp van sandwich-ELISA en multi-array ELISA-technologie in overeenstemming met de protocollen van de fabrikant. Analyse van endogeen DPP4 zal worden getest met behulp van een commerciële colorimetrische test; opnieuw zullen de protocollen van de fabrikant worden gevolgd. Biomarker- en DPP4-analyse zullen in één batch worden uitgevoerd op opgeslagen natriumheparine-plasmamonsters.

Statistieken Statistische methoden en analyses Basislijnkarakteristieken worden weergegeven per groep (degenen die momenteel een DPP-4-remmer krijgen, degenen die momenteel een GLP-1-analoog krijgen en degenen die momenteel geen DPP-4-remmer of GLP-1-analoog gebruiken) als gemiddelde en standaarddeviatie voor normaal gedistribueerde continue variabelen, mediaan en interkwartielbereik voor niet-normaal verdeelde continue variabelen, en tellingen en percentages voor categorische variabelen. De primaire uitkomst (EPC) zal worden vergeleken per behandelingsgroep met behulp van lineaire regressie, met en zonder correctie voor mogelijke confounders. De confounders waarmee rekening moet worden gehouden zijn leeftijd, geslacht, etniciteit, body mass index, duur van T2DM en insulinebehandeling. De gemiddelde EPC en het 95%-betrouwbaarheidsinterval in elk van de drie groepen zullen worden gepresenteerd, evenals het gemiddelde verschil tussen DPP-IV versus GLP-1-behandelingsgroep en tussen incretine versus niet-incretine-behandelingsgroepen. Een vergelijkbare analyse zal worden gebruikt voor alle continue secundaire uitkomsten. Binaire uitkomsten zullen worden vergeleken door groepen met behulp van logistische regressieanalyse met en zonder correctie voor dezelfde confounders. Alle statistische tests zijn tweezijdig en p<0,05 wordt als statistisch significant beschouwd.

Steekproefomvang Gebaseerd op het vermogen van 80% en significantie bij 0,025 (om twee primaire vergelijkingen mogelijk te maken, d.w.z. DPP-IV versus GLP-1-gebruikers en incretinegebruikers versus niet-incretinegebruikers), zullen 216 patiënten (72 in elk van de drie groepen) nodig zijn om een ​​verschil van 10 EPC/μl te detecteren, uitgaande van een SD van 19,2 tot de macht van 24. Met deze steekproefomvang kan ook een verschil van 8 pg/ml SDF-1α worden gedetecteerd met een vermogen van 75% uitgaande van een SD van 16 tot de macht van 24.

Gegevensbeheer Gegevensverzamelingsbladbeheer Alle klinische gegevens worden opgeslagen in een beveiligde ruimte in het Leicester Diabetes Centre. Elke ingeschreven proefpersoon krijgt een uniek studie-identificatienummer (ID) toegewezen, zodat de elektronische database anoniem blijft.

Het gegevensverzamelingsformulier (Case Report Form, CRF) is het primaire instrument voor gegevensverzameling. Er vindt een controle van het gegevensbeheer plaats en waar mogelijk worden ontbrekende gegevens toegelicht. Als het item niet van toepassing is op het individuele geval, wordt N.v.t. geschreven. Alle inzendingen worden leesbaar afgedrukt in zwarte inkt. Als er een invoerfout is gemaakt, wordt om de fout te corrigeren een enkele lijn getrokken door de onjuiste invoer en de juiste gegevens die erboven zijn ingevoerd. Al dergelijke wijzigingen zullen worden geparafeerd en gedateerd. Ter verduidelijking van onleesbare of onduidelijke vermeldingen zal de toelichting boven het item worden afgedrukt en deze zal worden geparafeerd en gedateerd.

Opslag, toegang, beveiliging, archivering van documentatie Alle onderzoeksdocumentatie met identificeerbare patiëntgegevens zal worden beheerd in overeenstemming met de International Conference on Harmonisation-Good Clinical Practice (ICH-GCP), Research Governance Framework for Health and Social Care en de Data Protection Act. Informatie wordt alleen van de patiënt verkregen als dit nodig is voor het onderzoek.

Alle elektronische gegevens worden opgeslagen op beveiligde universitaire (University of Leicester) of ziekenhuis (University Hospitals of Leicester NHS Trust) netwerkschijven, waartoe alleen het relevante onderzoekspersoneel toegang heeft, wat wordt verleend door het onderzoeksteam.

Alle onderzoeksdocumenten en -gegevens worden gedurende 5 jaar bewaard of het minimum dat wordt bepaald door de regelgevende instanties, afhankelijk van welke periode langer is. Het onderzoeksdossier wordt gearchiveerd in overeenstemming met het vertrouwensbeleid.

Vertrouwelijkheid van gegevens Elke deelnemer krijgt bij aanwerving een uniek identificatienummer toegewezen. De contactgegevens van patiënten worden in een aparte database bewaard en gebruikt om studiebezoeken te regelen. De database is beveiligd met een wachtwoord en alleen leden van het onderzoeksteam die contact opnemen met patiënten hebben toegang. Alle gegevens die tijdens het onderzoek worden verzameld, worden anoniem opgeslagen in een aparte database. Ook hier is de toegang beveiligd met een wachtwoord en beperkt tot relevante leden van het onderzoeksteam. Elektronische gegevens worden opgeslagen in het universiteits- of NHS-systeem.

Veiligheidskwesties De onderzoekers voorzien geen nadelige gebeurtenissen die kunnen worden toegeschreven aan het onderzoek, afgezien van de bijwerkingen die verband houden met het dagelijks leven en de routinematige gezondheidszorg. De studie omvat slechts één aderpunctie om veneus bloed af te nemen en brengt daarom een ​​zeer laag risico op ongewenste effecten met zich mee. Alle deelnemers ondergaan echter een aderpunctie, wat af en toe kan leiden tot blauwe plekken, zwellingen en tijdelijk ongemak.

De onderzoekers zullen de richtlijnen van de Universiteit van Leicester volgen voor het beheren en rapporteren van een Serious Adverse Event (SAE) of Suspected Unexpected Serious Adverse Reaction (SUSAR), die de richtlijnen van Good Clinical Practice (GCP) volgen.

Een SAE is elke bijwerking of onverwachte bijwerking die de dood tot gevolg heeft levensbedreigend is ziekenhuisopname of verlenging van bestaande ziekenhuisopname vereist resulteert in aanhoudende of significante invaliditeit of arbeidsongeschiktheid bestaat uit een aangeboren afwijking of geboorteafwijking. Bovendien zullen de onderzoekers een gebeurtenis ook als ernstig definiëren als het een belangrijke en significante medische gebeurtenis is die mogelijk niet onmiddellijk levensbedreigend is of de dood of ziekenhuisopname tot gevolg heeft, maar op basis van een passend medisch oordeel de patiënt in gevaar kan brengen of interventie kan vereisen om een of meer van de hierboven genoemde uitkomsten te voorkomen. Bijwerkingen die niet in deze categorieën vallen, worden gedefinieerd als niet-ernstig.

Alle SAE's zullen intern worden gerapporteerd aan de Universitaire Ziekenhuizen van Leicester (UHL), NHS Trust Research & Development (R&D) en de sponsor (Universiteit van Leicester) met behulp van de juiste rapportageformulieren, binnen 24 uur nadat het onderzoeksteam op de hoogte is van de gebeurtenis. De hoofdonderzoeker is verantwoordelijk voor de beoordeling en indiening van elke SAE, of bij diens afwezigheid, een ander lid van het team (om vertraging te voorkomen). Het dossier van de onderzoekslocatie bevat documentatie voor SAE-rapporten en bewijs van tijdige indiening.