Hodnocení lokálního doxycyklinu u kuřáků s chronickou parodontitidou

VI- Metody

1. Výběr vzorku

   Po předložení a schválení tohoto projektu Etické komisi pro výzkum (CEP) Zubní školy Piracicaba - UNICAMP, bude vybrán mezi pacienty, kteří spontánně vyhledávají léčbu na klinikách Absolvent FOP-UNICAMP (kde také proběhne klinická fáze studie), 40 pacientů s průměrným věkem mezi 30 a 59 lety, obou pohlaví (muž nebo žena) podle následujících kritérií pro zařazení:

   • Pacienti kuřáci, ale celkově dobrý zdravotní stav
   • pacienti, u kterých byla původně diagnostikována středně závažná nebo závažná chronická parodontitida (podle Americké akademie parodontologie-AAP, 1999), ověřili přítomnost radiografických periodontálních váčků a ztrátu kostní hmoty;
   • Pacienti, kteří mají nejméně čtyři místa krvácení s hloubkou sondování (PD) > 5 mm v uniradikulárních zubech.
   • Přítomnost minimálně 20 zubů;
   • formální souhlas s účastí na výzkumu po vysvětlení rizik a přínosů pro jednotlivce, kteří se na výzkumu nepodílejí. (usnesení č. 196 z října 1996 a etický kodex zubního lékaře (C.F.O.) 179/93).

   Kritéria vyloučení jsou:

   • periapikální nebo změna pulpy Přítomnost
   • Přítomnost systémových změn nebo užívání léků (6 měsíců před studií), které mohou ovlivnit odpověď na periodontální léčbu (např. fenytoin, cyklosporin, antagonisté vápníkových kanálů a protizánětlivé steroidy a nesteroidní);
   • Přítomnost přecitlivělosti na tetracykliny a jejich deriváty;
   • Zuby s postižením furkace v případě premolárů.
   • Těhotenství a kojení

2. Studovat design

   Studie bude klinická, randomizovaná, kontrolovaná, dvojitě zaslepená, s paralelním designem a léčba bude náhodně rozdělena mezi pacienty. Vybraní pacienti budou rozděleni do 2 skupin, jejichž zuby budou ošetřeny následovně:

   DB skupina (20 pacientů), - mechanický debridement v jednom sezení a aplikace placeba mikrokuliček ve čtyřech parodontálních váčcích větších než 5 mm DB + DOX skupina (20 pacientů), - mechanický debridement v jednom sezení spojený s aplikací 1 mg mikrokuliček nabité doxycyklinem na periodontální váček do čtyř míst rovných nebo větších než 5 mm.

   Mikrokuličky PLGA, použité v této studii jako systém řízeného dodávání léků, budou vyrobeny v Biomaterials Laboratory of Medicine Katolické univerzity v São Paulu, podle Moura, 2015. Mikrokuličky jsou naplněny hydrochloridem doxycyklinu (EMS Sigma Pharma-Generics, Hortolandia, Brazílie).

3. Výzkumný plán Vstupní vyšetření: Výběr 40 pacientů podle předem stanovených kritérií.

Úvodní terapie: Všichni pacienti budou poučeni o příčinách a důsledcích onemocnění parodontu a také o důležitosti preventivních technik (sulcular brushing a flossing) pro parodontální terapii. V této fázi dojde k supragingiválnímu parodontálnímu debridementu všech úst a odstranění retenčních faktorů plaku.

Léčba: Všichni pacienti budou léčeni subgingiválním debridementem úst stejným operátorem a za 3 měsíce budou vyšetřovatelem studie znovu posouzeni. Randomizace bude provedena prostřednictvím seznamu vygenerovaného počítačem.

Hodnocení léčby: Pacienti budou poučeni o ústní hygieně a bude jim prováděna odborná kontrola supragingiválního biofilmu při následných návštěvách. Pro standardizaci místa odběru klinických dat budou vyrobena vodící sondovací zařízení - "stenty" s akrylovými fóliemi o tloušťce 1 mm ve vakuové plastifikaci, pro průzkum míst s PS≥ 7 mm.

Klinické: Klinické parametry jsou:

1. Gingival Index - IG (Löe a Silness, 1963): Zánětlivé signály se shromažďují prostřednictvím následujících skóre: 0 (nepřítomnost zánětu dásní); 1 (mírný zánět - malá změna barvy, textury, absence krvácení při sondování); 2 (střední zánět – střední jas, zarudnutí, otok a hypertrofie, krvácení při sondování); 3 (těžký zánět – výrazné zarudnutí a hypertrofie; spontánní krvácení a sklon k ulceraci)
2. Index plaku - IP (Ainamo & Bay, 1975): Hodnocení přítomnosti / nepřítomnosti plaku v binominálním standardu. Počet tváří v kontaktu s dlahou vydělený počtem všech tváří v zubech pacienta 0 – žádný viditelný plak; 1- přítomnost viditelného plaku
3. Krvácení při sondování - SS (Mühlemann & Son, 1971): Standardní dichotomický. 0-nepřítomnost krvácení; 1- přítomnost krvácení.
4. poloha gingiválního okraje - PMG: vzdálenost demarkace ve "stentu" k volnému gingiválnímu okraji.

e Relativní klinická úroveň zavedení – NICR: vzdálenost demarkace ve „stentu“ k bázi, klinicky detekovatelná, periodontální kapsa.

f- Depth Survey - PS (NICR - PMG): vzdálenost od gingiválního okraje k bazi, klinicky detekovatelná, periodontální kapsa.

Všechny klinické parametry se získají pomocí periodontální sondy typu Severní Karolíny na začátku, 45 a 90 dnů poté.

Popis metod, které ovlivňují výzkumné subjekty:

Jakmile jsou dobrovolníci vybráni, obdrží všechny pokyny týkající se výzkumu souhlasu a informovanosti podle doporučení rezoluce 466/12 CNS. Jakékoli nepohodlí, které může být způsobeno ošetřením parodontálního debridementu ultrazvukem, se neliší od diskomfortu způsobeného ošetřením koronorradikulárního seškrabu, spočívajícího ve střední bolesti v ošetřované oblasti a možnosti hypersenzitivity dentinu v důsledku expozice dentinových kanálků na povrchu kořene. Aby se minimalizovalo možné nepohodlí pro tyto dobrovolníky, budou ve všech případech předepisována po léčbě analgetika a ústní voda fluoridový roztok, bez ohledu na to, zda se jedná o hypersenzitivitu dentinu či nikoli. Lokální podávání antibiotik (doxycyklin) nepředstavuje pro dobrovolníky žádné riziko, protože podaná dávka bude mít podle studií konzultovaných pro přípravu tohoto projektu pouze lokální účinky. Navíc, i když podané antibiotikum nežádoucím způsobem nedosahuje očekávaných výsledků, lze říci, že to nebude mít za následek vystavení pacienta nějakému druhu rizika, protože podaná dávka je nedostatečná ke zvýšení nepohodlí. Pokud však konvenční léčba s lokálním užíváním antibiotika nebo bez něj u některých pacientů nepřinese výsledky, budou mít prospěch z metod výchovy a objasnění ústní hygieny, které přispívají ke zlepšení kvality života pacientů. .

Mikrobiologické hodnocení:

Bude to provedeno polymerázovou řetězovou reakcí (PCR) v "reálném čase". Tento test umožní kvantitativní detekci následujících bakterií: Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia, Treponema denticola, Aggregatibacter actinomycetemcomitans a Prevotella intermedia, která se koná v Discipline of Periodontology Laboratories se sídlem ve FOP / UNICAMP.

1. odběr subgingivální Oblast pro odběr materiálu bude řádně izolována a vysušena sterilními bavlněnými rolemi. Část supragingiválního bakteriálního biofilmu se odstraní, aby se pak získaly vzorky subgingiválního plaku, umístěním proužků papíru (Periopaper - (OraFlow Inc., New York, USA)) do sáčků středních (5-6 mm) a hlubokých kapes (≥ 7 mm) každého pacienta po dobu 45 - 60 sekund. Objem odebrané gingivální štěrbinové tekutiny se měří přístrojem Periotron 8000 (OraFlow Inc., New York, USA) a papírové proužky se poté umístí do mikrocentrifugačních zkumavek (Eppendorf), kódovaných pro každého z pacientů, a 400 nebo 200 1 fosfátem pufrovaného fyziologický roztok (PBS) a 0,05% Tween-20.
2. Purifikace DNA Bakteriální kmeny získané z American Type Culture Collection (ATCC) P. intermedia (Pi) (ATCC 25611), P. gingivalis (Pg) (ATCC 33277), A. actinomycetemcomitans (Aa) (ATCC 29522) z kultury čisté T. denticola (Td) a T. forsythia (TF) budou použity jako pozitivní kontroly a standardy. Bakteriální DNA je purifikována pomocí DNA izolační sady PowerSoil® (MO BIO Laboratories, Inc.). Koncentrace DNA se upraví na 15 ng/ul ve vodě a poté se provede dalších šest ředění v 10-násobné sérii. Tři replikátní vzorky každého ředění (5 ul/vzorek) jsou poté testovány, jak je popsáno níže pro každou specifickou DNA. Citlivost každého testu byla stanovena jako nejnižší ředění DNA, které produkovalo statisticky významně nižší (p <0,001) vyšší hodnotu než kontrola bez templátu pomocí t-testu.
3. real PCR team NÁVRH PRIMERŮ: Budou použity "primery" specifické pro meziprodukty P., P. gingivalis, A. actinomycetemcomitans, T. a T. forsythensis denticola. Všechny "primery" budou zkontrolovány na jejich specifičnost ověřením křivky tání (získané po spuštění LightCycler) a spuštěním gelu pro ověření produktu.

OPTIMALIZACE REAKCÍ: Použití SYBR Green I vyžaduje získání specifických PCR produktů, na základě toho bude optimalizována účinnost odpovědí na "primer" před zahájením skutečných reakcí. Koncentrace v rozmezí od 2 do 5 mM MgCl2 a 0,2 až 0,5 uM každého "primeru" budou použity ke stanovení reakčních podmínek, které mají nejlepší účinnost. Tyto podmínky navrhuje výrobce zařízení.

REAKCE REAL-TIME PCR (RT-PCR): Reakce RT-PCR se provádějí pomocí systému LightCycler (Roche DiagnosticsGmbH, Mannheim, Německo) za použití soupravy "FastStart DNA Master SYBR Green I (Roche DiagnosticsCo.) ". Profil reakcí bude stanoven podle doporučení výrobce zařízení. Pro každý ze „závodních“ bude Aqua použit jako negativní kontrola a produkt reakce je kvantifikován pomocí vlastního programu výrobce (Software LightCyclerRelativeQuantification – DiagnosticsGmbH Roche).

imunoenzymatické hodnocení gingivální štěrbinové tekutiny Pro komplexní analýzu imuno-zánětlivých markerů přítomných v gingivální štěrbinové tekutině odebrané z periodontálních míst použije systém Luminex / Magpix pro identifikaci a kvantifikaci těchto zánětlivých markerů: IL-1β, IL- 4, IL-6, IL 8, IL-10, IL-17, IL-23, TGF-p, TNF-alfa, IFN-alfa a GM-CSF. Pro tuto analýzu se ke kuličkám značenému vzorku přidají monoklonální protilátky specifické pro každý marker, který má být kvantifikován. Po přidání kuliček se vzorek hybridizuje, umístí na plotny a inkubuje 2 hodiny při 37 °C. Destička se poté promyje a přidá se sekundární protilátka navázaná na substrát (biotin). Tato sestava se poté inkubuje po dobu 1 hodiny, dokud se po promytí neobjeví fluorescenční marker (Streptavidin / R-fykoerythrin). Destičky pak budou analyzovány přístrojovým programem Luminex 100 (MiraiBio, Alameda, CA, USA). To identifikuje a kvantifikuje fluorescenci každé kuličky, odpovídající zánětlivému markeru. Tato fluorescence je poté transformována pomocí standardních křivek (polonomiální ekvivalence třetího řádu) hodnoty jsou zpracovány v pg/ml.

Analýza aktivity proteolytických enzymů - zymografie Po třech měsících vyhodnotí přítomnost a aktivitu dvou proteolytických enzymů - MMP 9 (gelatináza - degraduje především kolagen typu IV) a MMP 8 (kolagenáza - hlavní degradace kolagenu typu I, II, III). dokončení mechanického subgingiválního debridementu. K tomuto účelu bude využita technika zymografie. Tato technika je založena na štěpení asociace mezi substrátem a ověření molekulové hmotnosti proteázy. Používá se k identifikaci proteolytické aktivity v enzymech separovaných (pásy) v polyakrylamidovém gelu za neredukčních podmínek. Gely jsou obarveny modří Coomassie a aktivita enzymu je demonstrována nepřítomností zabarvení (bílé pruhy) v oblastech, kde byl substrát degradován.

Gelová zymografie:

Gelová zymografie připomíná gelovou elektroforézu, která je rovněž namontována na deskový systém. Tento gel se skládá ze dvou částí: Počínaje gelem a separací gelu. Oba jsou rozděleni tak, že mají různé postavení a složení.