Utvärdering av lokalt doxycyklin hos rökare med kronisk parodontit

VI- Metoder

1. Provval

   Efter inlämning och godkännande av detta projekt till forskningsetiska kommittén (CEP) vid Piracicaba Dental School - UNICAMP, kommer att väljas ut bland de patienter som söker spontan behandling på kliniker Graduate FOP-UNICAMP (där också kommer att utföras den kliniska fasen av studie), 40 patienter med en medelålder mellan 30 och 59 år, av båda könen (man eller kvinna) enligt följande inklusionskriterier:

   • Patienter röker, men överlag god hälsa
   • patienter som initialt diagnostiserades med måttlig eller svår kronisk parodontit (enligt American Academy of Periodontology-AAP, 1999) verifierade förekomsten av radiografiska parodontala fickor och benförlust;
   • Patienter som har minst fyra blödningsställen med sonderingsdjup (PD) > 5 mm i uniradiculares tänder.
   • Förekomst av minst 20 tänder;
   • formellt samtycke att delta i forskning, efter att ha förklarat riskerna och fördelarna för individen som inte är involverad i den. (Resolution nr. 196 från oktober 1996 och Dental Code of Professional Ethics (C.F.O.) 179/93).

   Uteslutningskriterierna är:

   • periapikal eller pulpa förändring Närvaro
   • Förekomst av systemiska förändringar eller användning av mediciner (6 månader före studien) som kan påverka svaret på parodontal behandling (t.ex. fenytoin, ciklosporin, kalciumkanalantagonister och antiinflammatoriska steroider och icke-steroida);
   • Överkänslighet mot tetracykliner och deras derivat;
   • Tänder med inblandning furkation i fallet med premolarer.
   • Graviditet och amning

2. Studera design

   Studien kommer att vara klinisk, randomiserad, kontrollerad, dubbelblind, parallell design och behandlingarna är slumpmässigt fördelade mellan patienterna. Utvalda patienter kommer att delas in i 2 grupper, vars tänder får behandlingarna, enligt följande:

   DB-grupp (20 patienter), - mekanisk debridering i en session och applicering av placebo-mikrosfärer i fyra parodontala fickor större än 5 mm DB + DOX-grupp (20 patienter), - mekanisk debridering i en session i samband med applicering av 1 mg mikrosfärer laddad med doxycyklin per parodontalficka, på fyra platser lika med eller större än 5 mm.

   PLGA-mikrosfärerna, som används i denna studie som ett kontrollerat läkemedelstillförselsystem, kommer att produceras i Biomaterials Laboratory of Medicine vid katolska universitetet i São Paulo, enligt Moura, 2015. Mikrosfärerna är laddade med doxycyklinhydroklorid (EMS Sigma Pharma-Generics, Hortolandia, Brasilien).

3. Forskningsplan Inledande undersökning: Urval av 40 patienter enligt förutbestämda kriterier.

Initial terapi: Alla patienter kommer att utbildas om orsaker och konsekvenser av parodontit sjukdom samt om vikten av förebyggande tekniker (sulkulär borstning och tandtråd) för parodontitbehandling. I denna fas kommer det att ske supragingival parodontal debridering av all mun och avlägsnande av plackretentionsfaktorer.

Behandling: Alla patienter kommer att behandlas genom subgingival debridering av munnen, alla av samma operatör och kommer att omvärderas inom 3 månader av studiens utredare. Randomisering kommer att utföras genom en lista som genereras av datorn.

Behandlingsgenomgångar: Patienterna kommer att instrueras i munhygien och kommer att hållas professionell kontroll av supragingival biofilm vid uppföljningsbesök. För att standardisera placeringen av insamlingen av kliniska data kommer styrande sonderingsanordningar att göras - "stentar" med akrylskivor 1 mm tjocka i vakuumplastning, för att kartlägga platserna med PS≥ 7 mm.

Kliniskt: De kliniska parametrarna är:

1. Gingivalindex - IG (Löe och Silness, 1963): Inflammatoriska signaler samlas in genom följande poäng: 0 (frånvaro av gingival inflammation); 1 (lindrig inflammation - liten förändring i färg, textur, frånvaro av blödning vid sondering); 2 (måttlig inflammation - måttlig ljusstyrka, rodnad, svullnad och hypertrofi, blödning vid sondering); 3 (svår inflammation - markerad rodnad och hypertrofi; spontan blödning och benägenhet till sårbildning)
2. Plackindex - IP (Ainamo & Bay, 1975): Utvärdering av förekomst/frånvaro av plack i binominell standard. Antal ansikten i kontakt med plattan dividerat med antalet närvarande i alla ansikten patientens tänder 0- ingen synlig plack; 1- förekomst av synlig plack
3. Blödning vid sondering - SS (Mühlemann & Son, 1971): Standard dikotom. 0-frånvaro av blödning; 1- förekomst av blödning.
4. positionera tandköttskanten - PMG: avstånd för avgränsning i "stenten" till den fria tandköttskanten.

e Insertion Relative Clinical Level - NICR: avstånd för avgränsning i "stenten" till basen, kliniskt detekterbar, parodontala fickan.

f- Depth Survey - PS (NICR - PMG): avstånd från tandköttskanten till basen, kliniskt detekterbar, parodontala fickan.

Alla kliniska parametrar erhålls med användning av en periodontal sond av typen North Carolina vid baslinjen, 45 och 90 dagar efter.

Beskrivning av de metoder som påverkar forskningsämnena:

När de väl har valt studievolontärerna får de alla riktlinjer som rör samtycke och informerad forskning enligt rekommendationerna i resolution 466/12 från CNS. Eventuella besvär som kan orsakas av behandling av parodontit debridering med ultraljud skiljer sig inte från de som orsakas av behandling med koronorradikulär skrapning, bestående av måttlig smärta i det behandlade området och risken för dentinöverkänslighet på grund av exponering av dentintubuli på rotytan. För att minimera eventuellt obehag för dessa frivilliga kommer efterbehandlingssmärtor och munvattenfluoridlösning att ordineras i alla fall, oavsett om de har dentinala överkänsligheten eller inte. Lokal administrering av antibiotika (doxycyklin) utgör ingen risk för frivilliga, eftersom den administrerade dosen endast kommer att orsaka lokala effekter, enligt de studier som konsulterats för att förbereda detta projekt. Dessutom, även om det administrerade antibiotikumet på ett oönskat sätt inte uppnår de förväntade resultaten, kan det sägas att detta inte kommer att resultera i att patienten utsätts för någon form av risk, eftersom dosen som ska ges är otillräcklig för att orsaka ökat obehag. Ändå, om den konventionella behandlingen med eller utan lokal användning av antibiotikan inte ger resultat hos vissa patienter, kommer de att dra nytta av metoderna för utbildning i munhygien och förtydligande av munhälsa, som bidrar till att förbättra patienternas livskvalitet. .

Mikrobiologisk utvärdering:

Det kommer att göras genom polymeraskedjereaktion (PCR) i "realtid". Detta test kommer att möjliggöra kvantitativ detektering av följande bakterier: Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia, Treponema denticola, Aggregatibacter actinomycetemcomitans och Prevotella intermedia, som hålls i Discipline of Parodontology Laboratories, belägna i FOP / UNICAMP.

1. insamling av subgingival Området för insamling av material, kommer att vara ordentligt isolerat och torrt med sterila bomullsrullar. Delen av supragingival bakteriell biofilm avlägsnas för att sedan få prover av subgingival plack genom att placera pappersremsor (Periopaper - (OraFlow Inc., New York, USA)) inuti påsar måttliga (5-6 mm ) och djupa fickor (≥ 7) mm) av varje patient, i 45 - 60 sekunder. Volymen av gingival crevikulär vätska som samlas upp mäts med Periotron 8000 (OraFlow Inc., New York, USA) och pappersremsorna placeras sedan i mikrocentrifugrör (Eppendorf), kodade för var och en av patienterna, och 400 eller 200 l fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och 0,05 % Tween-20.
2. DNA-rening Bakteriestammarna erhållna från American Type Culture Collection (ATCC) P. intermedia (Pi) (ATCC 25611), P. gingivalis (Pg) (ATCC 33277), A. actinomycetemcomitans (Aa) (ATCC 29522) från en kultur ren T. dentcola (Td) och T.forsythia (TF) kommer att användas som positiva kontroller och standarder. Bakterie-DNA renas med hjälp av DNA-isoleringskit PowerSoil® (MO BIO Laboratories, Inc.). DNA-koncentrationen justeras till 15 ng/ul i vatten och därefter görs ytterligare sex utspädningar i 10-faldig serie. Tre replikatprover av varje spädning (5 ul/prov) analyseras sedan enligt beskrivningen nedan för varje specifikt DNA. Känsligheten för varje analys bestämdes som den lägsta utspädningen av DNA som producerade en statistiskt signifikant lägre (p <0,001) högre än kontrollen utan mall med användning av ett t-test.
3. verkligt PCR-team DESIGN AV PRIMER: De "primers" som är specifika för intermediära P., P. gingivalis, A. actinomycetemcomitans, T. och T. forsythensis dentico kommer att användas. Alla "primers" kommer att kontrolleras för deras specificitet genom att verifiera smältkurvan (erhållen efter att ha kört LightCycler) och körgel för produktverifiering.

OPTIMERING AV REAKTIONER: Användningen av SYBR Green I kräver att man skaffar specifika PCR-produkter, på den grunden kommer effektiviteten av svar på "primer" att optimeras innan de faktiska reaktionerna börjar. Koncentrationer som sträcker sig från 2 till 5 mM MgCl2 och 0,2 till 0,5 uM av varje "primer" kommer att användas för att bestämma reaktionsbetingelserna som har den bästa effektiviteten. Dessa villkor föreslås av tillverkaren av utrustningen.

REAKTIONER PÅ REALTIDS-PCR (RT-PCR): RT-PCR-reaktionerna utförs med LightCycler-systemet (Roche DiagnosticsGmbH, Mannheim, Tyskland) med hjälp av satsen "FastStart DNA Master SYBR Green I (Roche DiagnosticsCo.)". Profilen för reaktionerna kommer att bestämmas enligt utrustningstillverkarens rekommendationer. För varje "racing" kommer Aqua att användas som negativ kontroll, och produkten av reaktionen kvantifieras med hjälp av tillverkarens eget program (Software LightCyclerRelativeQuantification - DiagnosticsGmbH Roche).

immunoenzymatisk utvärdering av gingival crevikulär vätska För en omfattande analys av de immuninflammatoriska markörerna som finns i tandköttskrevikularvätskan som samlas in från parodontala platser, kommer Luminex / Magpix-systemet att använda för identifiering och kvantifiering av dessa inflammatoriska markörer: IL-1β, IL- 4, IL-6, IL 8, IL-10, IL-17, IL-23, TGF-p, TNF-alfa, IFN-alfa och GM-CSF. För denna analys, läggs till pärlor märkt prov till monoklonala antikroppar specifika för varje markör som ska kvantifieras. Efter tillsatsen av pärlorna hybridiseras provet och placeras på plattor och inkuberas i 2 timmar vid 37°C. Plattan tvättas sedan och en sekundär antikropp förenad med ett substrat (biotin) tillsätts. Denna sammansättning inkuberas sedan i 1 timme tills, efter tvätt, fluorescerande markör (Streptavidin/R-fykoerytrin). Plattorna kommer sedan att analyseras av ett Luminex 100 instrumentprogram (MiraiBio, Alameda, CA, USA). Detta identifierar och kvantifierar fluorescensen för varje kula, motsvarande den inflammatoriska markören. Denna fluorescens transformeras sedan med hjälp av standardkurvor (tredje ordningens polynomialekvation) värden bearbetas i pg/ml.

Analys av proteolytisk enzymaktivitet - zymografi Kommer att utvärdera närvaron och aktiviteten av två proteolytiska enzymer - MMP 9 (gelatinas - som huvudsakligen bryter ned kollagen typ IV) och MMP 8 (kollagenas - stor nedbrytning av kollagen typ I, II, III) efter tre månader av fullbordandet av debridement mekanisk subgingival. För detta ändamål kommer det att användas zymografiteknik. Denna teknik är baserad på smältning av association mellan substratet och verifiering av proteasets molekylvikt. Det används för att identifiera proteolytisk aktivitet i enzymer separerade (band) i en polyakrylamidgel under icke-reducerande förhållanden. Geler färgas med Coomassie-blått och enzymaktiviteten demonstreras av frånvaron av färgning (vita streck) i områden där substratet bröts ned.

Gel zymografi:

Gelzymografin liknar gelelektrofores som också är monterad på ett plattsystem. Denna gel består av två delar: Utgående från gelen och gelseparation. De två är delade eftersom de har olika position och sammansättning.