Paikallisen doksisykliinin arviointi tupakoitsijoilla, joilla on krooninen parodontiitti

VI- Menetelmät

1. Näytteen valinta

   Kun tämä projekti on toimitettu ja hyväksytty Piracicaban hammaslääkärikoulun tutkimuseettiselle komitealle (CEP), UNICAMP valitaan potilaiden joukosta, jotka hakeutuvat spontaanisti hoitoon klinikoilla Graduate FOP-UNICAMP (jossa myös suoritetaan hammaslääkärin kliininen vaihe). tutkimus), 40 potilasta, joiden keski-ikä oli 30–59 vuotta, molempia sukupuolia (mies tai nainen) seuraavien mukaanottokriteerien mukaisesti:

   • Potilaat tupakoivat, mutta yleisesti ottaen terve
   • potilaat, joilla oli alun perin diagnosoitu keskivaikea tai vaikea krooninen parodontiitti (American Academy of Periodontology-AAP, 1999 mukaan), varmistivat radiologisten parodontaalitaskujen ja luukadon olemassaolon;
   • Potilaat, joilla on vähintään neljä verenvuotokohtaa, joiden mittaussyvyys (PD) > 5 mm uniradiculares-hampaissa.
   • Vähintään 20 hampaan läsnäolo;
   • muodollinen suostumus tutkimukseen osallistumiseen sen jälkeen, kun on selvitetty riskit ja hyödyt henkilölle, joka ei osallistu siihen. (Päätös nro 196, lokakuu 1996 ja hammaslääketieteen ammattietiikka (C.F.O.) 179/93).

   Poissulkemiskriteerit ovat:

   • periapikaalinen tai pulpan muutos Läsnäolo
   • Systeemiset muutokset tai sellaisten lääkkeiden käyttö (6 kuukautta ennen tutkimusta), jotka voivat vaikuttaa parodontaalihoidon vasteeseen (esim. fenytoiini, syklosporiini, kalsiumkanavaantagonistit ja tulehduskipulääkkeet ja ei-steroidiset lääkkeet);
   • Yliherkkyys tetrasykliineille ja niiden johdannaisille;
   • Hampaat, joihin liittyy furkaatio esihampaiden tapauksessa.
   • Raskaus ja imetys

2. Opintojen suunnittelu

   Tutkimus on kliininen, satunnaistettu, kontrolloitu, kaksoissokkoutettu, rinnakkaissuunnittelu, ja hoidot jaetaan satunnaisesti potilaiden kesken. Valitut potilaat jaetaan 2 ryhmään, joiden hampaat saavat hoidot seuraavasti:

   DB-ryhmä (20 potilasta), - mekaaninen puhdistus yhdessä istunnossa ja plasebomikropallojen levitys neljään yli 5 mm:n parodontaalitaskuun DB + DOX -ryhmä (20 potilasta), - mekaaninen puhdistus yhdessä istunnossa, johon liittyy 1 mg:n mikropallojen levittäminen täynnä doksisykliiniä per parodontaalitasku neljään kohtaan, jotka ovat yhtä suuria tai suurempia kuin 5 mm.

   PLGA-mikropallot, joita käytetään tässä tutkimuksessa kontrolloituna lääkkeenantojärjestelmänä, valmistetaan São Paulon katolisen yliopiston lääketieteellisessä biomateriaalilaboratoriossa Mouran 2015 mukaan. Mikropallot ladataan doksisykliinihydrokloridilla (EMS Sigma Pharma-Generics, Hortolandia, Brasilia).

3. Tutkimussuunnitelma Alkututkimus: 40 potilaan valinta ennalta määritettyjen kriteerien mukaan.

Alkuhoito: Kaikille potilaille annetaan koulutusta parodontaalisairauksien syistä ja seurauksista sekä ennaltaehkäisytekniikoiden (sulkulaarinen harjaus ja hammaslangan käyttö) tärkeydestä periodontaalisessa hoidossa. Tässä vaiheessa suoritetaan koko suun supragingivaalinen periodontaalinen puhdistus ja plakkia pidättävien tekijöiden poistaminen.

Hoito: Kaikki potilaat hoitavat suun subgingivaalisella debridementillä sama operaattori, ja tutkimuksen tutkija arvioi heidät uudelleen 3 kuukauden kuluttua. Satunnaistaminen suoritetaan tietokoneen luoman luettelon avulla.

Arviot hoidosta: Potilaita opastetaan suuhygieniasta ja heillä on ammatillinen supragingivaalisen biofilmin valvonta seurantakäynneillä. Kliinisen tiedon keräämisen sijainnin standardoimiseksi tehdään ohjaavia koetuslaitteita - "stenttejä" akryylilevyillä, joiden paksuus on 1 mm tyhjiöpehmittimessä, alueiden kartoittamiseksi, joiden PS≥ 7 mm.

Kliiniset: Kliiniset parametrit ovat:

1. Gingival Index - IG (Löe ja Silness, 1963): Tulehdussignaalit kerätään seuraavien pistemäärien avulla: 0 (ientulehduksen puuttuminen); 1 (lievä tulehdus - pieni muutos värissä, koostumuksessa, verenvuodon puuttuminen mittauksessa); 2 (kohtalainen tulehdus - kohtalainen kirkkaus, punoitus, turvotus ja liikakasvu, verenvuoto koettaessa); 3 (vakava tulehdus - huomattava punoitus ja hypertrofia; spontaani verenvuoto ja taipumus haavaumiin)
2. Plakkiindeksi - IP (Ainamo & Bay, 1975): Arviointi plakin läsnäolosta / puuttumisesta binomimaalisessa standardissa. Levyssä olevien kasvojen lukumäärä jaettuna potilaan kaikkien kasvojen lukumäärällä 0 - ei näkyvää plakkia; 1 - näkyvän plakin läsnäolo
3. Verenvuoto koettaessa - SS (Mühlemann & Son, 1971): Standardi kaksijakoinen. 0 - verenvuodon puuttuminen; 1 - verenvuoto.
4. ienreunan sijainti - PMG: "stentin" demarkaation etäisyys vapaaseen ienmarginaaliin.

e Insertion Suhteellinen kliininen taso - NICR: "stentin" demarkaation etäisyys tyvestä, kliinisesti havaittavissa parodontaalitaskussa.

f- Depth Survey - PS (NICR - PMG): etäisyys ikenen reunasta tyveen, kliinisesti havaittavissa, parodontaalitasku.

Kaikki kliiniset parametrit saadaan käyttämällä North Carolina -tyyppistä periodontaalista koetinta lähtötilanteessa, 45 ja 90 päivän kuluttua.

Kuvaus menetelmistä, jotka vaikuttavat tutkimusaiheisiin:

Kun tutkimus vapaaehtoiset on valittu, he saavat kaikki suostumus- ja tietotutkimukseen liittyvät ohjeet CNS:n päätöslauselman 466/12 suositusten mukaisesti. Parodontaalin ultraäänipuhdistuksen mahdollisesti aiheuttamat epämukavuudet eivät eroa hoidon koronaradikulaarisesta raapimisesta aiheutuvista epämukavuudesta, joka koostuu keskivaikeasta kivusta hoidetulla alueella ja mahdollisesta dentiiniyliherkkyydestä, joka johtuu dentiinitubulusten paljastumisesta juuripinnalla. Mahdollisen epämukavuuden minimoimiseksi näille vapaaehtoisille määrätään kaikissa tapauksissa jälkihoitokipulääkettä ja suuveden fluoridiliuosta riippumatta siitä, esiintyykö hampaiden yliherkkyyttä vai ei. Antibioottien (doksisykliinin) paikallinen anto ei aiheuta riskiä vapaaehtoisille, koska annetulla annoksella on vain paikallisia vaikutuksia tämän projektin valmistelussa käytettyjen tutkimusten mukaan. Lisäksi, vaikka annettu antibiootti ei toivotulla tavalla saavuttaisi toivottuja tuloksia, voidaan sanoa, että tämä ei johda potilaan altistumiseen jonkinlaiselle riskille, koska annettava annos ei riitä aiheuttamaan lisääntynyttä epämukavuutta. Silti, jos perinteinen hoito antibiootin paikallisella käytöllä tai ilman ei tuota tulosta joillekin potilaille, he hyötyvät suuhygieniakasvatuksen ja suun terveyden selventämisen menetelmistä, jotka parantavat potilaiden elämänlaatua. .

Mikrobiologinen arviointi:

Se tehdään "reaaliaikaisen" polymeraasiketjureaktion (PCR) avulla. Tämä testi mahdollistaa seuraavien bakteerien kvantitatiivisen havaitsemisen: Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia, Treponema denticola, Aggregatibacter actinomycetemcomitans ja Prevotella intermedia, joita pidetään FOP / UNICAMPissa sijaitsevassa Parodontologian laboratorioissa.

1. subgingivalin kerääminen Materiaalin keräysalue eristetään kunnolla ja kuivataan steriileillä puuvillarullilla. Osa supragingivaalisesta bakteeribiofilmistä poistetaan näytteiden saamiseksi subgingivaalisesta plakista asettamalla paperiliuskoja (Periopaper - (OraFlow Inc., New York, USA)) keskikokoisten (5-6 mm) ja syvien taskujen (≥ 7) sisään. mm) jokaisesta potilaasta 45 - 60 sekunnin ajan. Kerätyn ienreuman nesteen tilavuus mitataan Periotron 8000 -laitteella (OraFlow Inc., New York, USA) ja sitten paperiliuskat asetetaan mikrosentrifugiputkiin (Eppendorf), jotka on koodattu kullekin potilaalle ja 400 tai 200 litraa fosfaattipuskuroitua. suolaliuosta (PBS) ja 0,05 % Tween-20:tä.
2. DNA:n puhdistus Bakteerikannat, jotka on saatu American Type Culture Collectionista (ATCC) P. intermedia (Pi) (ATCC 25611), P. gingivalis (Pg) (ATCC 33277), A. actinomycetemcomitans (Aa) (ATCC 29522) viljelmästä puhdasta T. denticolaa (Td) ja T. forsythiaa (TF) käytetään positiivisina kontrolleina ja standardeina. Bakteeri-DNA puhdistetaan käyttämällä DNA-eristyssarjaa PowerSoil® (MO BIO Laboratories, Inc.). DNA-konsentraatio säädetään arvoon 15 ng/ul vedessä ja sitten tehdään kuusi lisälaimennosta 10-kertaisessa sarjassa. Kolme rinnakkaisnäytettä kustakin laimennoksesta (5 ul/näyte) analysoidaan sitten alla kuvatulla tavalla kullekin spesifiselle DNA:lle. Kunkin määrityksen herkkyys määritettiin DNA:n pienimmäksi laimennokseksi, joka tuotti tilastollisesti merkitsevästi alhaisemman (p < 0,001) korkeamman tuloksen kuin kontrolli ilman templaattia käyttämällä t-testiä.
3. todellinen PCR-tiimi ALUEIDEN SUUNNITTELU: Välituotteelle P., P. gingivalis, A. actinomycetemcomitans, T. ja T. forsythensis denticola spesifisiä "alukkeita" käytetään. Kaikkien "alukkeiden" spesifisyys tarkistetaan tarkistamalla sulamiskäyrä (saatu LightCyclerin käytön jälkeen) ja käyttämällä geeliä tuotteen tarkistamista varten.

REAKTIOIDEN OPTIMOINTI: SYBR Green I:n käyttö edellyttää tiettyjen PCR-tuotteiden saamista, jonka perusteella "alukkeen" vasteiden tehokkuus optimoidaan ennen varsinaisten reaktioiden alkamista. Konsentraatioita välillä 2 - 5 mM MgCl2 ja 0,2 - 0,5 uM kutakin "aluketta" käytetään määrittämään reaktio-olosuhteet, joilla on paras tehokkuus. Nämä laitteen valmistajan ehdottamat ehdot.

REALIAIKAISEN PCR:n (RT-PCR) REAKTIOT: RT-PCR-reaktiot suoritetaan LightCycler-järjestelmällä (Roche DiagnosticsGmbH, Mannheim, Saksa) käyttämällä sarjaa "FastStart DNA Master SYBR Green I (Roche DiagnosticsCo.)". Reaktioiden profiili määritetään laitevalmistajan suositusten mukaisesti. Jokaisessa "kilpailussa" Aquaa käytetään negatiivisena kontrollina, ja reaktion tuote kvantifioidaan käyttämällä valmistajan omaa ohjelmaa (Software LightCyclerRelativeQuantification - DiagnosticsGmbH Roche).

Ienen ryppynesteen immunoentsymaattinen arviointi Jos haluat kattavan analyysin parodontaalikohteista kerätyssä ikenen rintanesteessä olevien immuuni-inflammatoristen markkerien avulla, käytetään Luminex / Magpix-järjestelmää näiden tulehdusmerkkiaineiden tunnistamiseen ja kvantifiointiin: IL-1β, IL- 4, IL-6, IL 8, IL-10, IL-17, IL-23, TGF-p, TNF-alfa, IFN-alfa ja GM-CSF. Tätä analyysiä varten lisätään helmiin leimattu näyte monoklonaalisille vasta-aineille, jotka ovat spesifisiä kullekin määritettävälle markkerille. Helmien lisäämisen jälkeen näyte hybridisoidaan levyille ja inkuboidaan 2 tuntia 37 °C:ssa. Sitten levy pestään ja lisätään substraattiin liitetty sekundäärinen vasta-aine (biotiini). Tätä kokoonpanoa inkuboidaan sitten 1 tunti, kunnes pesun jälkeen fluoresoiva markkeri (streptavidiini / R-fykoerytriini). Levyt analysoidaan sitten Luminex 100 -instrumenttiohjelmalla (MiraiBio, Alameda, CA, USA). Tämä identifioi ja kvantifioi kunkin helmen fluoresenssin, joka vastaa tulehdusmarkkeria. Tämä fluoresenssi muunnetaan sitten standardikäyrien avulla (kolmannen kertaluvun polynomiyhtälö) arvot käsitellään yksikössä pg/ml.

Proteolyyttisen entsyymin aktiivisuuden analyysi - tsymografia Arvioi kahden proteolyyttisen entsyymin - MMP 9:n (gelatinaasi - joka hajottaa pääasiassa tyypin IV kollageenin) ja MMP 8:n (kollagenaasi - kollageenin tyypin I, II, III merkittävä hajoaminen) - läsnäolon ja aktiivisuuden kolmen kuukauden kuluttua mekaanisen subgingivalin debridementin valmistumisesta. Tätä tarkoitusta varten käytetään tsymografiatekniikkaa. Tämä tekniikka perustuu substraatin välisen assosiaatioiden pilkkomiseen ja proteaasin molekyylipainon varmistamiseen. Sitä käytetään proteolyyttisen aktiivisuuden tunnistamiseen polyakryyliamidigeelissä erotetuissa (vyöhykkeissä) entsyymeissä ei-pelkistävissä olosuhteissa. Geelit värjätään Coomassie-sinisellä ja entsyymiaktiivisuus osoitetaan värin puuttumisena (valkoisia raitoja) alueilla, joissa substraatti oli hajonnut.

Geelitsymografia:

Geelitsymografia muistuttaa geelielektroforeesia, joka myös asennetaan levyjärjestelmään. Tämä geeli koostuu kahdesta osasta: alkaen geelistä ja geelin erottamisesta. Näillä kahdella on erilainen asema ja koostumus.