Bewertung von lokalem Doxycyclin bei Rauchern mit chronischer Parodontitis

VI- Methoden

1. Stichprobenauswahl

   Nach Einreichung und Genehmigung dieses Projekts bei der Forschungsethikkommission (CEP) der Piracicaba Dental School - UNICAMP, wird unter den Patienten ausgewählt, die spontan eine Behandlung in Kliniken suchen, Graduate FOP-UNICAMP (wo auch die klinische Phase der durchgeführt wird Studie), 40 Patienten mit einem Durchschnittsalter zwischen 30 und 59 Jahren, beiderlei Geschlechts (männlich oder weiblich) gemäß den folgenden Einschlusskriterien:

   • Patienten Raucher, aber insgesamt guter Gesundheitszustand
   • Patienten, bei denen anfänglich eine mittelschwere oder schwere chronische Parodontitis diagnostiziert wurde (gemäß der American Academy of Periodontology – AAP, 1999), bestätigten das Vorhandensein von röntgenologischen Parodontaltaschen und Knochenschwund;
   • Patienten mit mindestens vier Blutungsstellen mit Sondierungstiefe (PD) > 5 mm in uniradikulären Zähnen.
   • Vorhandensein von mindestens 20 Zähnen;
   • formelle Zustimmung zur Teilnahme an der Forschung, nachdem die Risiken und Vorteile für nicht daran beteiligte Personen erläutert wurden. (Resolution Nr. 196 vom Oktober 1996 und Berufsethikkodex für Zahnärzte (C.F.O.) 179/93).

   Die Ausschlusskriterien sind:

   • periapikale oder Pulpaveränderung vorhanden
   • Vorhandensein von systemischen Veränderungen oder Einnahme von Medikamenten (6 Monate vor der Studie), die das Ansprechen auf eine Parodontalbehandlung beeinflussen können (z. B. Phenytoin, Cyclosporin, Calciumkanalantagonisten und entzündungshemmende Steroide und nicht-steroidale);
   • Vorhandensein von Überempfindlichkeit gegen Tetracycline und ihre Derivate;
   • Zähne mit Beteiligung der Furkation bei Prämolaren.
   • Schwangerschaft und Stillzeit

2. Studiendesign

   Die Studie wird klinisch, randomisiert, kontrolliert, doppelblind und parallel angelegt sein, und die Behandlungen werden nach dem Zufallsprinzip auf die Patienten verteilt. Ausgewählte Patienten werden wie folgt in 2 Gruppen eingeteilt, deren Zähne behandelt werden:

   DB-Gruppe (20 Patienten), - mechanisches Debridement in einer Sitzung und Anwendung von Placebo-Mikrosphären in vier parodontalen Taschen mit mehr als 5 mm DB + DOX-Gruppe (20 Patienten), - mechanisches Debridement in einer Sitzung, verbunden mit der Anwendung von 1 mg Mikrosphären beladen mit Doxycyclin pro Parodontaltasche, an vier Stellen gleich oder größer als 5 mm.

   Die PLGA-Mikrosphären, die in dieser Studie als kontrolliertes Arzneimittelabgabesystem verwendet werden, werden laut Moura, 2015, im Biomaterials Laboratory of Medicine der Katholischen Universität von São Paulo hergestellt. Die Mikrokügelchen sind mit Doxycyclinhydrochlorid (EMS Sigma Pharma-Generics, Hortolandia, Brasilien) beladen.

3. Forschungsplan Eingangsuntersuchung: Auswahl von 40 Patienten nach vorher festgelegten Kriterien.

Anfangstherapie: Alle Patienten werden über die Ursachen und Folgen von Parodontalerkrankungen sowie über die Bedeutung von Präventionstechniken (Sullenbürsten und Zahnseide) für die Parodontaltherapie aufgeklärt. In dieser Phase erfolgt ein supragingivales parodontales Debridement des gesamten Mundes und die Entfernung von Plaque-Retentionsfaktoren.

Behandlung: Alle Patienten werden durch subgingivales Debridement des Mundes alle von demselben Operateur behandelt und in 3 Monaten vom Prüfarzt der Studie erneut beurteilt. Die Randomisierung erfolgt über eine computergenerierte Liste.

Behandlungsüberprüfung: Die Patienten werden in der Mundhygiene unterwiesen und erhalten bei Nachsorgeuntersuchungen die professionelle Kontrolle des supragingivalen Biofilms. Um den Ort der Sammlung klinischer Daten zu standardisieren, werden Sondenführungsgeräte hergestellt – „Stents“ mit 1 mm dicken Acrylplatten, die im Vakuum plastifiziert werden, um die Stellen mit PS≥ 7 mm zu untersuchen.

Klinisch: Die klinischen Parameter sind:

1. Zahnfleischindex – IG (Löe und Silness, 1963): Entzündungssignale werden durch die folgenden Bewertungen gesammelt: 0 (Fehlen einer Zahnfleischentzündung); 1 (leichte Entzündung – kleine Veränderung in Farbe, Textur, keine Blutung beim Sondieren); 2 (mäßige Entzündung – mäßige Helligkeit, Rötung, Schwellung und Hypertrophie, Blutung beim Sondieren); 3 (schwere Entzündung – deutliche Rötung und Hypertrophie; spontane Blutungen und Neigung zu Ulzerationen)
2. Plaque Index – IP (Ainamo & Bay, 1975): Bewertung des Vorhandenseins/Fehlens von Plaque im Binomialstandard. Anzahl der Flächen, die mit der Platte in Eingriff stehen, dividiert durch die Anzahl der Zähne des Patienten, die in allen Flächen vorhanden sind 0 – keine sichtbare Plaque; 1- Anwesenheit von sichtbarer Plaque
3. Blutung beim Sondieren - SS (Mühlemann & Sohn, 1971): Standard dichotom. 0 – keine Blutung; 1- Anwesenheit von Blutungen.
4. Position Gingivarand - PMG: Abstand der Begrenzung im „Stent“ zum freien Gingivarand.

e Insertion Relative Clinical Level – NICR: Abstand der Demarkation im „Stent“ zur Basis, klinisch nachweisbar, der parodontalen Tasche.

f- Tiefenmessung – PS (NICR – PMG): Abstand vom Zahnfleischsaum zur Basis, klinisch nachweisbar, der parodontalen Tasche.

Alle klinischen Parameter werden unter Verwendung einer parodontalen Sonde des North-Carolina-Typs zu Studienbeginn sowie 45 und 90 Tage danach erhalten.

Beschreibung der Methoden, die die Forschungsthemen betreffen:

Sobald die Freiwilligen der Studie ausgewählt wurden, erhalten sie alle Richtlinien in Bezug auf die Einwilligung und informierte Forschung gemäß den Empfehlungen der Resolution 466/12 der CNS. Jegliche Beschwerden, die durch eine parodontale Debridement-Behandlung mit Ultraschall verursacht werden können, unterscheiden sich nicht von denen, die durch die Behandlung mit koronorradikulärem Schaben verursacht werden, bestehend aus mäßigen Schmerzen im behandelten Bereich und der Möglichkeit einer Dentinüberempfindlichkeit aufgrund der Freilegung von Dentinkanälchen auf der Wurzeloberfläche. Um mögliche Beschwerden für diese Freiwilligen zu minimieren, werden ihnen in allen Fällen Analgetika und Mundwasser mit Fluoridlösung nach der Behandlung verschrieben, unabhängig davon, ob sie eine Dentinüberempfindlichkeit aufweisen oder nicht. Die lokale Verabreichung von Antibiotika (Doxycyclin) stellt kein Risiko für Freiwillige dar, da die verabreichte Dosis laut den Studien, die für die Vorbereitung dieses Projekts herangezogen wurden, nur lokale Wirkungen hervorruft. Selbst wenn das verabreichte Antibiotikum unerwünschterweise nicht die erwarteten Ergebnisse erzielt, kann man außerdem sagen, dass dies nicht dazu führt, dass der Patient irgendeiner Art von Risiko ausgesetzt wird, da die zu verabreichende Dosis nicht ausreicht, um erhöhte Beschwerden zu verursachen. Wenn die konventionelle Behandlung mit oder ohne lokale Anwendung des Antibiotikums bei manchen Patienten dennoch keine Ergebnisse bringt, profitieren sie von den Methoden der Mundhygieneerziehung und Mundgesundheitsaufklärung, die zur Verbesserung der Lebensqualität der Patienten beitragen .

Mikrobiologische Bewertung:

Es wird durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) der "Echtzeit" durchgeführt. Dieser Test ermöglicht den quantitativen Nachweis der folgenden Bakterien: Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia, Treponema denticola, Aggregatibacter actinomycetemcomitans und Prevotella intermedia, gehalten in den Discipline of Periodontology Laboratories, ansässig in FOP / UNICAMP.

1. Entnahme von subgingivalem Material Der Bereich für die Entnahme von Material wird ordnungsgemäß isoliert und mit sterilen Watterollen trocken. Der Teil des supragingivalen bakteriellen Biofilms wird entfernt, um dann Proben der subgingivalen Plaque zu erhalten, indem Papierstreifen (Periopaper – (OraFlow Inc., New York, USA)) in Taschen mit mittlerer (5–6 mm) und tiefer Tasche (≥ 7,0 mm) platziert werden mm) jedes Patienten für 45 - 60 Sekunden. Das Volumen der gesammelten Zahnfleischtaschenflüssigkeit wird mit dem Periotron 8000 (OraFlow Inc., New York, USA) gemessen und die Papierstreifen werden dann in Mikrozentrifugenröhrchen (Eppendorf) gegeben, für jeden der Patienten kodiert, und 400 oder 200 l phosphatgepuffert Kochsalzlösung (PBS) und 0,05 % Tween-20.
2. DNA-Reinigung Die Bakterienstämme wurden von der American Type Culture Collection (ATCC) P. intermedia (Pi) (ATCC 25611), P. gingivalis (Pg) (ATCC 33277), A. actinomycetemcomitans (Aa) (ATCC 29522) aus einer Kultur erhalten reine T. denticola (Td) und T.forsythia (TF) werden als positive Kontrollen und Standards verwendet. Die bakterielle DNA wird unter Verwendung des DNA-Isolierungskits PowerSoil® (MO BIO Laboratories, Inc.) gereinigt. Die DNA-Konzentration wird auf 15 ng/ul in Wasser eingestellt und dann werden weitere sechs Verdünnungen in 10-facher Reihe hergestellt. Drei Wiederholungsproben jeder Verdünnung (5 ul/Probe) werden dann wie unten beschrieben für jede spezifische DNA getestet. Die Sensitivität jedes Assays wurde als die niedrigste DNA-Verdünnung bestimmt, die einen statistisch signifikant niedrigeren (p < 0,001) höheren Wert als die Kontrolle ohne Matrize unter Verwendung eines t-Tests erzeugte.
3. echtes PCR-Team PRIMERENTWURF: Es werden die für intermediäre P., P. gingivalis, A. actinomycetemcomitans, T. und T. forsythensis denticola spezifischen "Primer" verwendet. Alle „Primer“ werden auf ihre Spezifität überprüft, indem die Schmelzkurve (erhalten nach dem Lauf des LightCyclers) und das Laufgel zur Produktüberprüfung verifiziert werden.

OPTIMIERUNG DER REAKTIONEN: Die Verwendung von SYBR Green I erfordert die Beschaffung spezifischer PCR-Produkte, auf deren Grundlage die Wirksamkeit der Reaktionen auf "Primer" vor dem Start der eigentlichen Reaktionen optimiert wird. Konzentrationen im Bereich von 2 bis 5 mM MgCl 2 und 0,2 bis 0,5 uM jedes "Primers" werden verwendet, um die Reaktionsbedingungen zu bestimmen, die die beste Effizienz aufweisen. Diese Bedingungen werden vom Hersteller des Geräts vorgeschlagen.

REAKTIONEN DER ECHTZEIT-PCR (RT-PCR): Die RT-PCR-Reaktionen werden mit dem LightCycler-System (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland) unter Verwendung des Kits „FastStart DNA Master SYBR Green I (Roche Diagnostics Co.)“ durchgeführt. Das Profil der Reaktionen wird gemäß den Empfehlungen des Geräteherstellers bestimmt. Für jedes "Rennen" wird Aqua als Negativkontrolle verwendet, und das Produkt der Reaktion wird mit dem herstellereigenen Programm (Software LightCyclerRelativeQuantification - DiagnosticsGmbH Roche) quantifiziert.

immunenzymatische Bewertung der Zahnfleischtaschenflüssigkeit Für eine umfassende Analyse der immun-entzündlichen Marker, die in der Zahnfleischtaschenflüssigkeit vorhanden sind, die an parodontalen Stellen gesammelt wurde, wird das Luminex/Magpix-System zur Identifizierung und Quantifizierung dieser Entzündungsmarker verwendet: IL-1β, IL- 4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-17, IL-23, TGF-β, TNF-alpha, IFN-alpha und GM-CSF. Für diese Analyse werden zu mit Kügelchen markierten Proben monoklonale Antikörper gegeben, die für jeden zu quantifizierenden Marker spezifisch sind. Nach der Zugabe der Kügelchen wird die hybridisierte Probe auf Platten platziert und für 2 Stunden bei 37°C inkubiert. Die Platte wird dann gewaschen und ein mit einem Substrat (Biotin) verbundener sekundärer Antikörper wird hinzugefügt. Diese Anordnung wird dann für 1 Stunde inkubiert, bis nach dem Waschen ein Fluoreszenzmarker (Streptavidin/R-Phycoerythrin) entsteht. Die Platten werden dann mit einem Luminex 100-Instrumentenprogramm (MiraiBio, Alameda, CA, USA) analysiert. Dies identifiziert und quantifiziert die Fluoreszenz jeder Perle, die dem Entzündungsmarker entspricht. Diese Fluoreszenz wird dann transformiert, mittels Standardkurven (Polynomgleichung dritter Ordnung) werden Werte in pg/ml verarbeitet.

Analyse der proteolytischen Enzymaktivität – Zymographie Bewertet das Vorhandensein und die Aktivität von zwei proteolytischen Enzymen – MMP 9 (Gelatinase – die hauptsächlich Kollagen Typ IV abbaut) und MMP 8 (Kollagenase – Hauptabbau von Kollagen Typ I, II, III) nach drei Monaten des Abschlusses des mechanischen subgingivalen Debridements. Zu diesem Zweck wird die Zymographie-Technik verwendet. Diese Technik basiert auf dem Abbau der Assoziation zwischen dem Substrat und der Verifizierung des Molekulargewichts der Protease. Es wird verwendet, um proteolytische Aktivität in Enzymen zu identifizieren, die (Banden) in einem Polyacrylamidgel unter nicht reduzierenden Bedingungen getrennt wurden. Die Gele werden mit Coomassie-Blau gefärbt, und die Enzymaktivität wird durch das Fehlen einer Färbung (weiße Streifen) in Bereichen, in denen das Substrat abgebaut wurde, demonstriert.

Gel-Zymographie:

Die Gelzymographie ähnelt der Gelelektrophorese, ebenfalls auf einem Plattensystem montiert. Dieses Gel besteht aus zwei Teilen: Ausgehend vom Gel und der Geltrennung. Die beiden sind so geteilt, dass sie unterschiedliche Positionen und Zusammensetzungen haben.