Korelace děložních a umbilikálních tepen Doppler s placentární patologií v IUGR

Pokud je to indikováno, byl proveden konzervativní plán léčby IUGR podle definovaného protokolu včetně prenatálních návštěv a ultrazvukového sledování. Frekvence sledování plodu byla hodnocena při každé návštěvě podle stavu matky a plodu.

Dopplerovské studie byly provedeny během posledního týdne před porodem s použitím 3,5-MHz převodníku, mapování barevného toku a 50-Hz vysokofrekvenčního filtru; všechna měření byla prováděna s matkami v pololehu. K zobrazení vzestupné větve děložních tepen bylo použito barevné zobrazení toku. Pulzní dopplerovská velocimetrie byla provedena s objemem vzorku 5 mm.

Pro každé vyšetření byly pořízeny minimálně tři samostatné záznamy. Vlnový obrys děložních tepen byl studován na přítomnost diastolického zářezu, ze kterého byl vypočten poměr systolický/koncový diastolický (S/D). Abnormální děložní velocimetrie byla definována jako průměr (levého a pravého) poměru S/D a bilaterální přítomností diastolického zářezu. Tvar vlny pupeční tepny byl měřen z volně plovoucí smyčky šňůry během fetálního klidu. Byl vypočten index pulsatility (PI) (maximální rychlost - minimální rychlost/střední rychlost) a byl použit průměr ze tří měření. Abnormální PI umbilikální arterie byla definována jako standardní odchylky nad průměrem referenčních standardů založených na gestačním věku (Chitty a Altman, 1999).

Výsledky dopplerovské velocimetrie Umbilikální arterie (UA) byly kategorizovány jako normální (koncová diastolická rychlost < 90. percentil naší referenční křivky), zvýšené (koncová diastolická rychlost ≥ 90. percentil), nepřítomné a obrácené (Madazil R et al., 2002) Pacienti byli přijati k pečlivému sledování v případě zhoršení stavu matky nebo plodu (např. chybějící nebo obrácený průtok krve UA a těžká preeklampsie). Preeklampsie byla definována podle standardních kritérií (Arduini D et al, 2002).

Vzorky tkání Byly hodnoceny obecné tvary placent. Odebrané placenty byly zváženy oříznutím membrán a pupeční šňůry. Poté byly zaznamenány průměry a tloušťka placent. Byla sledována poloha úponu pupečníku na fetálním povrchu placenty. Byly provedeny příčné řezy přes mateřský povrch ve vzdálenosti 1-2 cm způsobem bochníku chleba a vyšetřeny na světlé oblasti. Všechny placenty byly přes noc ponořeny do 10% formalínu a vyšetřeny další den. Pro každou placentu byly připraveny bloky obsahující šňůru, membránu a plnou tloušťku vilózní tkáně. Bloky vilózní tkáně o celé tloušťce byly získány ze tří zón, i) centrální zóny, ii) periferní zóny a iii) střední zóny mezi prvními dvěma zónami, tak, aby zahrnovaly všechny oblasti placenty.

Biopsie placentárního lůžka byly získány při císařských řezech s přímou vizualizací místa placenty. Byly odebrány biopsie o velikosti alespoň 1 cm. Vzorky byly fixovány v pufrovaném formalínu. Tkáně byly zpracovány a obarveny hematoxlyinem a eosinem. Mikroskopická studie placenty byla provedena s využitím souboru standardních kritérií pro vilózní a intervilózní léze (Kotigwar S et al 2011). Pro studium těchto kritérií bylo vybráno 8 náhodných mikroskopických polí a v každém poli bylo spočítáno 100 klků a studována přítomnost následujících kritérií:

1. Syncytiální uzly > 30 % v jednom poli
2. Fibrinoidní nekróza >5 % v jednom poli
3. Infarkt placenty >5 % v jednom poli Intervilózní prostor

a) Chorangióza b) Perivilózní ukládání fibrinoidů >5 % v jednom poli c) Infarkt d) Přítomnost kalcifikace. e) Ztluštělé hylinózované krevní cévy Pro statistické účely jsou takové změny označeny jako „Abnormální placenta“

Imunohistochemie Exprese VEGF a CD34 byla analyzována v 75 (50 placenta IUGR a 25 kontrolních) placentárních vilózních tkáních. Vzorky (1,5 × 1,5 × 1 cm v průměru) odebrané z mateřského povrchu každé placenty; infarktové oblasti byly ze studie vyloučeny. Všechny tkáně byly fixovány ve formalínu, zality v parafínu a nařezány na 5 μm silné řezy, které byly odebrány na sklíčka potažená poly-L-lysinem. Po odstranění parafínu byly řezy rehydratovány.

Imunobarvení bylo provedeno streptavidin-biotin-peroxidázovou metodou. Aktivita endogenní peroxidázy byla blokována pomocí 3% peroxidu vodíku. Získávání antigenu bylo prováděno v mikrovlnné troubě po dobu 15 minut v 10 nM citrátovém pufru (pH 6,0) pro VEGF. Řezy byly inkubovány při teplotě místnosti po dobu jedné hodiny s králičími polyklonálními protilátkami EP1176Y reaktivními s VEGF (1:100; Genova, Španělsko), myšími monoklonálními protilátkami CD34 Ventana. USA). Po promytí ve fosfátem pufrovaném fyziologickém roztoku pomocí Tween-20 byly tkáně inkubovány se sekundární protilátkou konjugovanou s biotinem a poté s komplexem biotin-streptavidin po dobu 30 minut při teplotě místnosti. Reakce byly vizualizovány 3,3-diaminobenzidin tetrahydrochloridem (DAB). Řezy byly kontrastně obarveny hematoxylinem, opláchnuty a připevněny.

Hodnocení imunohistochemického barvení

Vyhodnocení imunohistochemického barvení CD34:

Stanovení hustoty mikrocév

Nejpopulárnější metodou pro studium angiogenní aktivity v tkáni je spočítat počet mikrocév na jednotku plochy tkáňového řezu, známé jako hustota mikrocév (MVD). (Hasan J et al, 2002) K určení MVD, obarvené vaskulatury placenty. Tkáňové řezy byly zpočátku mikroskopicky vyšetřovány při nízkém výkonu (100×), aby se identifikovaly oblasti s nejvyšší vaskularizací ("horká místa"). Poté bylo náhodně vybráno pět vysoce výkonných (400×) polí a pro každý vzorek byl s použitím okulárové mřížky spočítán počet mikrocév v každém vysoce výkonném poli (0,09 mm2). MVD pro každý vzorek byla brána jako průměr z pěti získaných hodnot. (Mustafa G et al, 2012)

Vyhodnocení imunohistochemického barvení VEGF:

Byla hodnocena intenzita a lokalizace barvicí reakce v choriových vilózních stromálních buňkách, vaskulárních hladkých svalových buňkách, vilózních vaskulárních endoteliálních buňkách, cytotrofoblastech, syncytiotrofoblastech a extravilózních trofoblastech. Imunoreaktivita pro protilátky byla hodnocena pomocí semikvantitativní stupnice pro intenzitu barvení: 0 negativní, žádné barvení; 1+ slabě pozitivní; 2+ středně pozitivní; 3+ silně pozitivní. (Barut F a kol., 2010)