Correlazione del Doppler delle arterie uterine e ombelicali con la patologia placentare in IUGR

Quando indicato, è stato intrapreso un piano di gestione conservativa di IUGR secondo un protocollo definito che includeva visite prenatali, sorveglianza ecografica. La frequenza della sorveglianza fetale è stata valutata ad ogni visita in base alle condizioni materne e fetali.

Gli studi Doppler sono stati eseguiti nell'ultima settimana prima del parto utilizzando un trasduttore da 3,5 Mhz, mappatura del flusso di colore e un filtro passa-alto da 50 Hz; tutte le misurazioni sono state eseguite con le madri in posizione semi sdraiata. L'imaging del flusso di colore è stato utilizzato per visualizzare il ramo ascendente delle arterie uterine. La velocimetria pulsata Doppler è stata eseguita con un volume di campione di 5 mm.

Per ogni esame sono state effettuate almeno tre registrazioni separate. Il contorno ondulatorio delle arterie uterine è stato studiato per la presenza di una tacca diastolica da cui è stato calcolato il rapporto sistolico/telediastolico (S/D). La velocimetria uterina anomala è stata definita come media del rapporto S/D (destro e sinistro) e dalla presenza bilaterale di notching diastolico. La forma d'onda dell'arteria ombelicale è stata misurata dall'ansa del cordone fluttuante durante la quiescenza fetale. È stato calcolato l'indice di pulsatilità (PI) (velocità massima - velocità minima/velocità media) ed è stata utilizzata la media di tre misurazioni. Un PI anormale dell'arteria ombelicale è stato definito come deviazioni standard al di sopra della media per gli standard di riferimento basati sull'età gestazionale (Chitty e Altman, 1999).

I risultati della velocimetria Doppler dell'arteria ombelicale (UA) sono stati classificati come normali (velocità telediastolica <90° percentile della nostra curva di riferimento), aumentati (velocità telediastolica ≥90° percentile), assenti e invertiti (Madazil R et al., 2002) I pazienti venivano ricoverati per stretta sorveglianza in caso di peggioramento delle condizioni materne o fetali (es. flusso sanguigno UA assente o invertito e grave preeclampsia). La preeclampsia è stata definita secondo criteri standard (Arduini D et al, 2002).

Campioni di tessuto Sono state valutate le forme generali delle placente. Le placente raccolte sono state pesate tagliando le membrane e il cordone ombelicale. Quindi sono stati annotati i diametri e lo spessore delle placente. È stata osservata la posizione di inserimento del cordone ombelicale sulla superficie fetale della placenta. Sono stati praticati tagli trasversali attraverso la superficie materna a una distanza di 1-2 cm a pagnotta ed esaminati per le aree pallide. Tutte le placente sono state immerse in formalina al 10% durante la notte ed esaminate il giorno successivo. Per ogni placenta sono stati preparati blocchi contenenti cordone, membrana e tutto lo spessore del tessuto villoso. Blocchi di tessuto villoso a tutto spessore sono stati ottenuti da tre zone, i) zona centrale ii) zona periferica e iii) zona intermedia tra le prime due zone, in modo da includere tutte le aree della placenta.

Le biopsie del letto placentare sono state ottenute a taglio cesareo con visualizzazione diretta del sito placentare. Sono state prelevate biopsie di almeno 1 cm. I campioni sono stati fissati in formalina tamponata. I tessuti sono stati processati e colorati con ematossilina ed eosina. Lo studio microscopico della placenta è stato condotto utilizzando una serie di criteri standard per le lesioni villose e intervillose (Kotigwar S et al 2011). Per studiare questi criteri sono stati scelti 8 campi microscopici casuali e 100 villi sono stati contati in ciascun campo e studiati per la presenza dei seguenti criteri:

1. Nodi sinciziali >30% in un campo
2. Necrosi fibrinoide >5% in un campo
3. Infarto placentare >5% in un campo Spazio intervilloso

a) Corangiosi b) Deposizione fibrinoide perivillosa >5% in un campo c) Infarti d) Presenza di calcificazioni. e) Vasi sanguigni ispessiti e ispessiti A scopo statistico tali alterazioni sono etichettate come "Placenta anormale"

Immunoistochimica L'espressione di VEGF e CD34 è stata analizzata in 75 (50 placenta di IUGR e 25 di controllo) tessuti dei villi placentari. Campioni (1,5 × 1,5 × 1 cm di diametro) prelevati dalla superficie materna di ciascuna placenta; le aree di infarto sono state escluse dallo studio. Tutti i tessuti sono stati fissati in formalina, incorporati in paraffina e tagliati in sezioni spesse 5 μm, che sono state raccolte su vetrini rivestiti con poli-L-lisina. Dopo che la paraffina è stata rimossa, le sezioni sono state reidratate.

L'immunocolorazione è stata eseguita con il metodo streptavidina-biotina-perossidasi. L'attività della perossidasi endogena è stata bloccata utilizzando perossido di idrogeno al 3%. Il recupero dell'antigene è stato effettuato in un forno a microonde per 15 minuti in tampone citrato 10 nM (pH 6,0) per VEGF. Le sezioni sono state incubate a temperatura ambiente per un'ora con anticorpi policlonali di coniglio EP1176Y reattivi con VEGF (1:100; Genova, Spagna), anticorpi monoclonali di topo CD34 Ventana. STATI UNITI D'AMERICA). Dopo il lavaggio in soluzione salina tamponata con fosfato con Tween-20, i tessuti sono stati incubati con un anticorpo secondario coniugato con biotina e quindi con un complesso biotina-streptavidina per 30 minuti a temperatura ambiente. Le reazioni sono state visualizzate con 3,3-diaminobenzidina tetracloridrato (DAB). Le sezioni sono state controcolorate con ematossilina, risciacquate e montate.

Valutazione della colorazione immunoistochimica

Valutazione della colorazione immunoistochimica di CD34:

Determinazione della densità dei microvasi

Il metodo più diffuso per studiare l'attività angiogenica in un tessuto consiste nel contare il numero di microvasi per unità di area della sezione di tessuto, nota come densità dei microvasi (MVD). (Hasan J et al, 2002) Per determinare la MVD, la vascolarizzazione placentare macchiata. Le sezioni di tessuto sono state inizialmente esaminate al microscopio a bassa potenza (100 ×) per identificare le aree di maggiore vascolarizzazione ("punti caldi"). Cinque campi ad alta potenza (400 ×) sono stati quindi scelti casualmente e il numero di microvasi in ciascun campo ad alta potenza (0,09 mm2) è stato contato per ciascun campione con l'uso di una griglia oculare. La MVD per ciascun campione è stata presa come media dei cinque valori ottenuti. (Mustafa G et al, 2012)

Valutazione della colorazione immunoistochimica del VEGF:

È stata valutata l'intensità e la localizzazione della reazione di colorazione nelle cellule stromali dei villi coriali, nelle cellule muscolari lisce vascolari, nelle cellule endoteliali vascolari villose, nei citotrofoblasti, nei sinciziotrofoblasti e nei trofoblasti extravilli. L'immunoreattività per gli anticorpi è stata valutata utilizzando una scala semiquantitativa per l'intensità della colorazione: 0 negativo, nessuna colorazione; 1+ debolmente positivo; 2+ moderatamente positivo; 3+ fortemente positivo. (Barut F et al, 2010)