Kohdun ja napavaltimon Dopplerin korrelaatio istukan patologian kanssa IUGR:ssä

Tarvittaessa IUGR:n konservatiivinen hoitosuunnitelma tehtiin määritellyn protokollan mukaisesti, mukaan lukien synnytyskäynnit ja ultraäänivalvonta. Sikiön seurannan tiheys arvioitiin jokaisella käynnillä äidin ja sikiön tilan mukaan.

Doppler-tutkimukset suoritettiin viimeisen viikon aikana ennen toimitusta käyttämällä 3,5 MHz:n anturia, värivirtauskartoitusta ja 50 Hz:n ylipäästösuodatinta; kaikki mittaukset suoritettiin äitien ollessa puoliksi makuuasennossa. Värivirtakuvausta käytettiin kohdun valtimoiden nousevan haaran visualisoimiseen. Pulssi-Doppler-nopeusmittaus suoritettiin 5 mm:n näytetilavuudella.

Jokaisesta tutkimuksesta otettiin vähintään kolme erillistä tallennetta. Kohdun valtimoiden aaltokäyrää tutkittiin diastolisen loven varalta, josta laskettiin systolinen/loppudiastolinen (S/D) -suhde. Epänormaali kohdun nopeusmitta määriteltiin (vasemmalla ja oikealla) S/D-suhteen keskiarvona ja molemminpuolisena diastolisen loven esiintymisenä. Napavaltimon aaltomuoto mitattiin vapaasti kelluvasta nyörilenkistä sikiön lepotilan aikana. Pulsiteettiindeksi (PI) (maksiminopeus - miniminopeus/keskinopeus) laskettiin ja käytettiin kolmen mittauksen keskiarvoa. Epänormaali napavaltimon PI määriteltiin keskihajotuksiksi, jotka ylittivät gestaatioikään perustuvien vertailustandardien keskiarvon (Chitty ja Altman, 1999).

Napavaltimon (UA) Doppler-nopeusmittarin tulokset luokiteltiin normaaliksi (diastolinen loppunopeus < 90. prosenttipiste vertailukäyrästämme), lisääntyneiksi (diastolinen loppunopeus ≥ 90. prosenttipiste), poissa oleviksi ja käänteisiksi (Madazil R et al., 2002) Potilaat otettiin tarkkaan seurantaan äidin tai sikiön tilan huonontuessa (esim. poissaoleva tai käänteinen UA-verenkierto ja vaikea preeklampsia). Preeklampsia määriteltiin standardikriteerien mukaan (Arduini D et al, 2002).

Kudosnäytteet Istukan yleiset muodot arvioitiin. Kerätyt istukat punnittiin leikkaamalla kalvot ja napanuora. Sitten istukan halkaisijat ja paksuus merkittiin muistiin. Napanuoran kiinnityskohta istukan sikiön pinnalla havaittiin. Poikittaisleikkaukset tehtiin emon pinnan läpi 1-2 cm:n etäisyydeltä leipäna ja tarkasteltiin vaaleat alueet. Kaikki istukat upotettiin 10-prosenttiseen formaliiniin yön yli ja tutkittiin seuraavana päivänä. Jokaista istukasta varten valmistettiin lohkot, jotka sisälsivät napanuoran, kalvon ja koko paksuuden villikudoksen. Kokopaksuisia villoisia kudoslohkoja saatiin kolmelta vyöhykkeeltä, i) keskivyöhykkeeltä ii) reunavyöhykkeeltä ja iii) kahden ensimmäisen vyöhykkeen väliseltä välivyöhykkeeltä, jotta kaikki istukan alueet sisältyivät.

Istukan pohjabiopsiat otettiin keisarinleikkauksilla istukan kohdan suoralla visualisoinnilla. Otettiin vähintään 1 cm:n biopsiat. Näytteet kiinnitettiin puskuroidussa formaliinissa. Kudokset käsiteltiin ja värjättiin hematokslyiinilla ja eosiinilla. Istukan mikroskooppinen tutkimus suoritettiin käyttämällä standardikriteereitä villos- ja intervillous-vaurioille (Kotigwar S et al 2011). Näiden kriteerien tutkimiseen valittiin 8 satunnaista mikroskooppista kenttää ja kussakin kentässä laskettiin 100 villiä ja tutkittiin seuraavien kriteerien esiintymistä:

1. Syntyaaliset solmut >30% yhdessä kentässä
2. Fibrinoidinekroosi > 5 % yhdessä kentässä
3. Istukkainfarkti >5 % yhdessä kentässä Vilkkujen väli

a) Chorangioosi b) Perivillous fibrinoidikertymä >5 % yhdessä kentässä c) Infarktit d) Kalkkeutumista. e) Sakeutuneet hylinoidut verisuonet Tilastollista tarkoitusta varten tällaiset muutokset merkitään "epänormaali istukka"

Immunohistokemia VEGF:n ja CD34:n ilmentyminen analysoitiin 75:ssä (50 ug IUGR:n istukassa ja 25 ui kontrollissa) istukan villouskudosta. Näytteet (halkaisijaltaan 1,5 × 1,5 × 1 cm), jotka on otettu kunkin istukan äidin pinnalta; infarktialueet jätettiin tutkimuksen ulkopuolelle. Kaikki kudokset kiinnitettiin formaliiniin, upotettiin parafiiniin ja leikattiin 5 μm:n paksuisiksi paloiksi, jotka kerättiin poly-L-lysiinillä päällystetyille objektilaseille. Kun parafiini oli poistettu, leikkeet rehydratoitiin.

Immunovärjäys suoritettiin streptavidiini-biotiini-peroksidaasi-menetelmällä. Endogeeninen peroksidaasiaktiivisuus estettiin käyttämällä 3-prosenttista vetyperoksidia. Antigeenin talteenotto suoritettiin mikroaaltouunissa 15 minuutin ajan 10 nM sitraattipuskurissa (pH 6,0) VEGF:lle. Leikkeitä inkuboitiin huoneenlämpötilassa yksi tunti kanin EP1176Y polyklonaalisten vasta-aineiden kanssa, jotka olivat reaktiivisia VEGF:n (1:100; Genova, Espanja), CD34 hiiren monoklonaalisten vasta-aineiden kanssa, Ventana. USA). Sen jälkeen kun kudoksia oli pesty fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa Tween-20:lla, kudoksia inkuboitiin biotiiniin konjugoidun sekundaarisen vasta-aineen kanssa ja sitten biotiini-streptavidiinikompleksin kanssa 30 minuuttia huoneenlämpötilassa. Reaktiot visualisoitiin 3,3-diaminobentsidiinitetrahydrokloridilla (DAB). Leikkeet vastavärjättiin hematoksyliinillä, huuhdeltiin ja kiinnitettiin.

Immunohistokemiallisen värjäyksen arviointi

CD34:n immunohistokemiallisen värjäytymisen arviointi:

Mikroverisuonitiheyden määritys

Suosituin menetelmä angiogeenisen aktiivisuuden tutkimiseksi kudoksessa on laskea mikrosuonten lukumäärä kudosleikkeen pinta-alayksikköä kohti, joka tunnetaan nimellä mikrosuonitiheys (MVD). (Hasan J et al, 2002) MVD:n määrittämiseksi, värjäytyneen istukan verisuoniston. Kudosleikkeet seulottiin alun perin mikroskooppisesti pienellä teholla (100 x) korkeimman verisuonittuneisuuden alueiden ("kuumien pisteiden") tunnistamiseksi. Sitten valittiin satunnaisesti viisi suuritehoista kenttää (400×), ja kunkin näytteen mikrosuonten lukumäärä jokaisessa suuritehokentässä (0,09 mm2) laskettiin silmäverkon avulla. Jokaisen näytteen MVD otettiin viiden saadun arvon keskiarvoksi. (Mustafa G et al, 2012)

VEGF:n immunohistokemiallisen värjäytymisen arviointi:

Värjäytymisreaktion intensiteetti ja lokalisointi korionivilloisissa stroomasoluissa, verisuonten sileissä lihassoluissa, villoisissa verisuonten endoteelisoluissa, sytotrofoblasteissa, synsytiotrofoblasteissa ja ekstravilloisissa trofoblasteissa arvioitiin. Immunoreaktiivisuus vasta-aineille pisteytettiin käyttämällä puolikvantitatiivista asteikkoa värjäytymisen intensiteetille: 0 negatiivinen, ei värjäytymistä; 1+ heikko positiivinen; 2+ kohtalaisen positiivinen; 3+ vahvasti positiivinen. (Barut F et al, 2010)