Kombinace rekombinantních bakteriálních ACE2 receptorů – jako je enzym B38-CAP a isotretinoin by mohla být slibnou léčbou infekce COVID-19 – a jejích zánětlivých komplikací

Toto je malá pilotní studie zkoumající, zda existuje nějaký signál o účinnosti, který by zaručoval větší studii fáze 2B, nebo jakákoli újma, která naznačuje, že by se taková studie neměla provádět. Očekává se, že přinese statisticky významné výsledky v hlavních koncových bodech. Zkoušející prozkoumá všechna biologická, fyziologická a klinická data, aby určil, zda je hodnocení fáze 2B oprávněné.

• Primární analýza účinnosti bude provedena pouze u pacientů, kteří dostanou alespoň 4 dávky aktivního kombinovaného léčiva. Bezpečnostní analýza bude provedena u všech pacientů, kteří dostanou alespoň jednu dávku účinné látky. Plánuje se zapsat více než nebo rovných 24 subjektů s COVID-19. Očekává se, že bude mít alespoň 12 hodnotitelných pacientů v každé skupině.
• Experimentální skupina: 0,4 mg/kg IV BID po dobu 7 dnů (nezaslepeno) plus 13 cis retinová kyselina ve formě aerosolu postupně ve 2 dílčích dávkách zvyšuje od 0,2 mg/kg/den do 4 mg/kg/den jako inhalační isotretinoinovou terapii po dobu 14 dnů a standardní péče Kontrolní skupina: standardní péče Délka intervence: do 14 dnů terapie Žádná plánovaná průběžná analýza.

Kombinace rekombinantních bakteriálních receptorů ACE2 – enzymu B38-CAP a isotretinoinu by mohla být slibnou léčbou infekce COVID-19 – a jejích zánětlivých komplikací

Mahmúd ELkazzaz1

1Katedra chemie a biochemie, Přírodovědecká fakulta, Damietta University, GOEIC, Egypt.

_________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Úvod

Receptory angiotenzin konvertujícího enzymu-2 (ACE2) zprostředkovávají vstup do buňky tří kmenů koronaviru: SARS-CoV, NL63 a SARS-CoV-2. Receptory ACE2 jsou všudypřítomné a široce exprimované v srdci, cévách, střevech, plicích (zejména v pneumocytech a makrofázích typu 2), ledvinách, varlatech a mozku. ACE2 je většinou vázán na buněčné membrány a jen stěží je přítomen v oběhu v rozpustné formě. Důležitou prospěšnou funkcí membránově vázaného a rozpustného ACE2 je degradace angiotenzinu II na angiotenzin1-7. V důsledku toho receptory ACE2 omezují několik škodlivých účinků vyplývajících z vazby angiotensinu II na receptory AT1, které zahrnují vazokonstrikci, zesílený zánět a trombózu. Zvýšená tvorba angiotensinu 1-7 také spouští protiregulační ochranné účinky prostřednictvím vazby na G-proteiny spojené s Mas receptory. Bohužel vstup SARS-CoV2 do buněk prostřednictvím membránové fúze výrazně snižuje receptory ACE2, přičemž dochází ke ztrátě katalytického účinku těchto receptorů na vnějším místě membrány. Zvýšený zánět plic a koagulace byly hlášeny jako nežádoucí účinky zesílených a neoponovaných účinků angiotensinu II prostřednictvím osy receptoru ACE→Angiotenzin II→AT1. Klinické zprávy pacientů infikovaných SARS-CoV-2 ukazují, že několik znaků spojených s infekcí a závažností onemocnění (tj. vyšší věk, hypertenze, diabetes, kardiovaskulární onemocnění) sdílí různý stupeň nedostatku ACE2. Navrhujeme, že down-regulace ACE2 vyvolaná virovou invazí může být zvláště škodlivá u lidí s výchozím deficitem ACE2 spojeným s výše uvedenými stavy. Další nedostatek ACE2 po virové invazi může zesílit dysregulaci mezi „nepříznivou“ osou receptoru ACE→Angiotenzin II→AT1 a „ochrannou“ osou receptoru ACE2→Angiotenzin1-7→Mas. V plicích by taková dysregulace upřednostňovala progresi zánětlivých a trombotických procesů spouštěných lokální hyperaktivitou angiotensinu II, které by nebránil angiotensin 1-7. V tomto nastavení by rekombinantní brACE2 mohl být slibným terapeutickým přístupem u pacientů s infekcí SARS-CoV-2.

Záchrana systému renin-angiotenzin (RAS) pomocí B38-CAP ACE2, což je enzym podobný ACE2 odvozený od bakterií

Očekávané přínosy enzymu podobného ACE2 odvozenému od B38-CAP v závislosti na předchozích výzkumných datech ukazují, že enzym podobný ACE2 odvozený od B38-CAP bude plnit stejnou funkci jako lidský ACE2 a zároveň bude odolný vůči proteinu COVID-spike, protože evolučně je příliš daleko od lidského ace2 a lidský ACE2 je skutečným receptorem enzymu COVID-19, nikoli ACE2, a o tom se diskutuje následovně:

B38-CAP je enzym podobný ACE2 odvozený od bakterií, který potlačuje hypertenzi a srdeční dysfunkci Enzym konvertující angiotenzin 2 (ACE2) je kriticky zapojen do kardiovaskulární fyziologie a patologie a je v současné době klinicky hodnocen k léčbě akutního selhání plic. Zde ukazujeme, že B38-CAP, karboxypeptidáza odvozená z Paenibacillus sp. B38 je enzym podobný ACE2, který snižuje hladiny angiotenzinu II u myší. Při analýze struktury proteinu 3D sdílí homolog B38-CAP strukturní podobnost se savčím ACE2 s nízkou sekvenční identitou. Rekombinantní protein B38-CAP in vitro katalyzoval konverzi angiotensinu II na angiotenzin 1-7, stejně jako další známé cílové peptidy ACE2. Léčba B38-CAP potlačila angiotensinem II indukovanou hypertenzi, srdeční hypertrofii a fibrózu u myší. Navíc B38-CAP inhiboval patologickou hypertrofii vyvolanou tlakovým přetížením, myokardiální fibrózu a srdeční dysfunkci u myší. Naše data identifikují bakteriální B38-CAP jako karboxypeptidázu podobnou ACE2, což naznačuje, že evoluce zformovala bakteriální karboxypeptidázu na lidský enzym podobný ACE2. Bakteriální inženýrství by mohlo být využito k navržení zlepšených proteinových léků pro hypertenzi a srdeční selhání. Naopak bylo prokázáno, že léčba rekombinantním lidským ACE2 proteinem (rhACE2), který postrádá svou membránově ukotvenou doménu, takže je rozpustná, vykazuje příznivé účinky na různých zvířecích modelech, včetně srdečního selhání, akutního poškození plic a diabetické nefropatie atd. dále. rhACE2 je v současné době testován na klinice k léčbě pacientů infikovaných ARDS a COVID-19. Pomocí buněčných kultur a organoidů vědci z Karolinska Institute ve Švédsku a University of British Columbia (UBC) v Kanadě prokázali, že přidáním geneticky modifikované varianty ACE2, nazývané lidský rekombinantní rozpustný angiotensin-konvertující enzym 2 (hrsACE2), COVID -19 bylo zabráněno ve vstupu do cel. Práce publikovaná v Cell ukazuje, že hrsACE2 měl na dávce závislý účinek na růst viru SARS-CoV-2 a dokázal jej v buněčných kulturách snížit faktorem 1 000 až 5 000. Navzdory svým příznivým účinkům je rhACE2 glykosylovaný protein, a proto jeho příprava vyžaduje časově a finančně náročný proteinový expresní systém se savčími nebo hmyzími buňkami, což nemusí být výhodné při vývoji léčiv a lékařské ekonomice. Ačkoli bylo hlášeno, že imunitní odpověď je spojena s chronickou infuzí rhACE2 vedoucí k degradaci rhACE226, toto nebylo pozorováno u B38-CAP; v séru myší infuzí B38-CAP po dobu 2 týdnů nebyly detekovatelné žádné protilátky proti B38-CAP. Implantace osmotických minipump plněných B38-CAP významně potlačila hypertenzi indukovanou Ang II u myší při vědomí. ovlivňující srdeční frekvenci. Tyto výsledky ukazují, že B38-CAP antagonizuje vazopresorický účinek Ang II. Hlavní výzkumník tedy očekává a navrhuje, že léčba klonovanými bakteriálními receptory ACE2 – podobným enzymem B38-CAP by mohla být slibným lékem zabraňujícím infekci COVID-19 a poškození plic lépe než rekombinantní lidský ACE2 kromě brsACE2, od kterého se očekává, že přiláká virus k připojí se ke kopii místo skutečných buněk… Odvádí to od viru od infikování buněk ve stejné míře a mělo by to vést ke snížení růstu viru v plicích a dalších orgánech. Studie ukázala, že rekombinantní protein B38-CAP snižuje hladiny Ang II u myší a antagonizuje hypertenzi indukovanou Ang II, patologickou srdeční hypertrofii a fibrózu myokardu. Studie prokázala příznivé účinky B38-CAP na patologii srdečního selhání vyvolaného tlakovým přetížením u myší bez zjevné toxicity a také předléčení B38-CAP výrazně snížilo masivní zvýšení plazmatických hladin Ang II 5 minut po injekci Ang II. k současně používaným lékům k inhibici tvorby nebo signalizace Ang II, jako jsou inhibitory ACE nebo blokátory receptoru angiotensinu, je přímá down-modulace hladin Ang II proteinem rhACE2 jedním ze slibných kandidátů na novou terapeutickou strategii u kardiovaskulárních onemocnění a dalších Ang II - související nemoci, např. ARDS. Na druhé straně, i když je masová produkce rhACE2 jako proteinového léčiva nákladná kvůli požadavku na expresní systémy savčích buněk, B38-CAP se snadno připravuje pomocí expresního systému E. coli a je nákladově efektivní. Terapeutická účinnost a menší toxicita v modelech srdečního selhání u myší by zaručovala další zkoumání B38-CAP nebo jiných mikrobiálních karboxypeptidáz v modelech onemocnění. Kromě toho by lidský enzym podobný ACE2 v bakteriích mohl připravit cestu k nové strategii inženýrství evoluce bakteriálních proteinů pro lepší navrhování a přípravu rekombinantních proteinových léčiv Konečně hlavní výzkumník očekává, že léčba enzymem podobným ACE2 u bakterií B38-CAP může provádět stejný mechanismus jako rhACE2 při inhibici COVID-19 a dalším navrhovaným mechanismem je, že enzym podobný ACE2 v bakteriích B38-CAP injekce v lidském těle bude vykonávat stejnou funkci jako lidský ACE2 a zároveň bude odolný vůči Protein COVID-spike, protože je evolučně příliš daleko od lidského ace2 a lidský ACE2 je skutečným receptorem COVID-19, nikoli enzymu podobného ACE2, a také ze tří bakteriálních karboxypeptidáz, které jsme testovali, pouze B38-CAP vykazoval závislost proteolytické aktivity na koncentraci aniontu , která je charakteristická pro aktivitu ACE2. B38-CAP také vykazoval pH optimum 7,5 ekvivalentu rhACE2. Navíc IC50 MLN-4760 byla také ekvivalentní mezi rhACE2 a B38-CAP. Ačkoli B38-CAP vykazoval docela podobnou proteolytickou aktivitu jako rhACE2, zdá se, že mezi dvěma enzymy existuje rozdíl v substrátové specifitě, takže hlavní výzkumník také očekává, že enzym podobný B38-CAP ACE2 nemusí být rozpoznáván spike proteinem COVID-19, ale ve stejném časem bude mít stejnou funkci jako lidský ACE2, navíc k downregulaci lidského ACE2, který je skutečným receptorem COVID-19

Blokování ACE2 receptoru COVID-19, což jsou jeho skutečné receptory

Isotretinoin (13cis RA) může být schopen inhibovat vstup COVID 2019 prostřednictvím downregulace ACE2 prostřednictvím akce, jako je shRNA zacílená na expresi genu ACE2, a to je diskutováno následovně:

Pandemie COVID-19 způsobená SARS-COV-2 infikovala více než 2 000 000 lidí a způsobila více než 150 000 úmrtí. Klíčovým hostitelským buněčným proteinem potřebným pro vstup viru je angiotensin-konvertující enzym 2 (ACE2), jehož exprese byla prokázána v mnoha tkáních včetně alveolárních epiteliálních buněk typu II v plicích, ústní sliznici a střevě, srdci, ledvinách, endotelu a kůži. Buňky exprimující ACE2 mohou fungovat jako domácí buňky a jsou náchylné k infekci SARS-CoV-2, protože receptor ACE2 usnadňuje vstup a replikaci buněčného viru. Studie prokázala, že pacienti s hypertenzí a diabetes mellitus mohou mít vyšší riziko infekce SARS-CoV-2, protože tito pacienti jsou často léčeni inhibitory ACE (ACEI) nebo blokátory receptorů angiotenzinu II typu I (ARB), které byly dříve navrhoval zvýšit expresi ACE2. V další studii Sinha et al, kteří analyzovali veřejně dostupný soubor dat Connectivity Map (CMAP) před/po transkriptomických profilů pro léčbu léků v buněčných liniích pro více než 20 000 malých molekul, byl isotretinoin nejsilnějším down-regulátorem ACE 2 receptorů. Na druhou stranu našli v CMAP 6 léků, které jsou v současné době zkoumány v klinických studiích pro léčbu COVID-19 (chlorochin, thalidomid, methylprednisolon, losartan, lopinavir a ritonavir, z Clinictrials.gov), u žádného z nich nebylo zjištěno, že by významně měnilo expresi ACE2 (P>0,1) Kromě toho další studie prokázala, že isotretinoin je potenciální inhibitor proteázy podobné papainu (PLpro), což je protein kódovaný geny SARS-CoV-2 a považován za jeden z proteinů, na který by se měla zaměřit léčba COVID-19 prováděním virtuálních cílových skríning ligandů, jak byl hlavní řešitel diskutovaný dříve (13cRA) je nejsilnější down-regulátor ACE2. a hlavní výzkumník očekává, že 13cRA může inhibovat a downregulovat expresi ACE2, což naznačuje její terapeutický potenciál při prevenci vstupu COVID 2019 do hostitelské buňky.