Kombination af rekombinante bakterielle ACE2-receptorer - som enzym af B38-CAP og isotretinoin kunne være lovende behandling for COVID-19-infektion - og dens inflammatoriske komplikationer

Dette er et lille pilotstudie, der undersøger, om der er et effektsignal, der berettiger et større fase 2B-forsøg, eller nogen skade, der tyder på, at et sådant forsøg ikke bør udføres. Det forventes at give statistisk signifikante resultater i de vigtigste endepunkter. Investigatoren vil undersøge alle de biologiske, fysiologiske og kliniske data for at afgøre, om et fase 2B-forsøg er berettiget.

• Primær effektivitetsanalyse udføres kun på patienter, der modtager mindst 4 doser aktivt kombinationslægemiddel. Sikkerhedsanalyse vil blive udført på alle patienter, der modtager mindst én dosis aktivt lægemiddel. Det er planlagt at tilmelde mere end eller lig med 24 forsøgspersoner med COVID-19. Det forventes at have mindst 12 evaluerbare patienter i hver gruppe.
• Eksperimentel gruppe: 0,4 mg/kg IV BID i 7 dage (ublindet) plus aerosoliseret 13 cis retinsyre i gradvise 2 opdelte doser stigninger fra 0,2 mg/kg/dag til 4 mg/kg/dag som inhaleret isotretinoinbehandling i 14 dage og standard of care Kontrolgruppe: standard of care Interventionsvarighed: op til 14 dages behandling Ingen planlagt interimanalyse.

Kombination af rekombinante bakterielle ACE2-receptorer -lignende enzym af B38-CAP og Isotretinoin kunne være lovende behandling for COVID-19 infektion - og dens inflammatoriske komplikationer

Mahmoud ELkazzaz1

1 Institut for kemi og biokemi, Det Naturvidenskabelige Fakultet, Damietta University, GOEIC, Egypten.

__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Introduktion

Angiotensin-konverterende enzym-2 (ACE2)-receptorer medierer adgangen til cellen af ​​tre stammer af coronavirus: SARS-CoV, NL63 og SARS-CoV-2. ACE2-receptorer er allestedsnærværende og udtrykkes bredt i hjertet, kar, tarm, lunger (især i type 2-pneumocytter og makrofager), nyrer, testikler og hjerne. ACE2 er for det meste bundet til cellemembraner og er kun sjældent til stede i kredsløbet i opløselig form. En vigtig gavnlig funktion af membranbundet og opløseligt ACE2 er nedbrydningen af ​​angiotensin II til angiotensin1-7. Følgelig begrænser ACE2-receptorer adskillige skadelige virkninger som følge af binding af angiotensin II til AT1-receptorer, som omfatter vasokonstriktion, øget inflammation og trombose. Den øgede dannelse af angiotensin1-7 udløser også kontraregulerende beskyttende virkninger gennem binding til G-proteinkoblede Mas-receptorer. Desværre nedregulerer indtrængen af ​​SARS-CoV2 i cellerne gennem membranfusion markant ACE2-receptorer, med tab af den katalytiske effekt af disse receptorer på det ydre sted af membranen. Øget lungebetændelse og koagulation er blevet rapporteret som uønskede virkninger af forstærkede og ikke-modvirkende angiotensin II-effekter via ACE→ Angiotensin II→AT1-receptoraksen. Kliniske rapporter om patienter inficeret med SARS-CoV-2 viser, at adskillige træk forbundet med infektion og sygdommens sværhedsgrad (dvs. ældre alder, hypertension, diabetes, kardiovaskulær sygdom) deler en variabel grad af ACE2-mangel. Vi foreslår, at ACE2-nedregulering induceret af viral invasion kan være særligt skadelig hos personer med baseline ACE2-mangel forbundet med ovenstående tilstande. Den yderligere ACE2-mangel efter viral invasion kan forstærke dysreguleringen mellem den 'ugunstige' ACE → Angiotensin II → AT1-receptorakse og den 'beskyttende' ACE2 → Angiotensin1-7 → Mas-receptoraksen. I lungerne vil en sådan dysregulering begunstige progressionen af ​​inflammatoriske og trombotiske processer udløst af lokal angiotensin II-hyperaktivitet uden modsætning til angiotensin1-7. I denne indstilling kunne rekombinant braACE2 være lovende terapeutiske tilgange til patienter med SARS-CoV-2-infektion.

Redning af renin-angiotensin-systemet (RAS) af B38-CAP ACE2, som er et bakterie-afledt ACE2-lignende enzym

De forventede fordele ved B38-CAP-afledt ACE2-lignende enzym afhængigt af tidligere forskningsdata viser, at B38-CAP-afledt ACE2-lignende enzym vil udføre den samme funktion som humant ACE2, og på samme tid vil det være resistent over for COVID-spike-protein, fordi evolutionært er det for langt væk fra human ace2 og human ACE2 er en reel receptor for COVID-19 ikke ACE2-lignende enzym, og dette diskuteres som følger:

B38-CAP er et bakterie-afledt ACE2-lignende enzym, der undertrykker hypertension og hjertedysfunktion Angiotensin-konverterende enzym 2 (ACE2) er kritisk involveret i kardiovaskulær fysiologi og patologi og er i øjeblikket klinisk evalueret til behandling af akut lungesvigt. Her viser vi, at B38-CAP, en carboxypeptidase afledt af Paenibacillus sp. B38, er et ACE2-lignende enzym til at reducere angiotensin II-niveauer hos mus. I protein 3D-strukturanalyse deler B38-CAP-homolog strukturel lighed med pattedyrs ACE2 med lav sekvensidentitet. In vitro katalyserede rekombinant B38-CAP-protein omdannelsen af ​​angiotensin II til angiotensin 1-7, såvel som andre kendte ACE2-målpeptider. Behandling med B38-CAP undertrykte angiotensin II-induceret hypertension, hjertehypertrofi og fibrose hos mus. Desuden hæmmede B38-CAP trykoverbelastningsinduceret patologisk hypertrofi, myokardiefibrose og hjertedysfunktion hos mus. Vores data identificerer den bakterielle B38-CAP som en ACE2-lignende carboxypeptidase, hvilket indikerer, at evolutionen har formet en bakteriel carboxypeptidase til et humant ACE2-lignende enzym. Bakterieteknik kunne bruges til at designe forbedrede proteinlægemidler til hypertension og hjertesvigt. Tværtimod har behandling med rekombinant humant ACE2-protein (rhACE2), som er blottet for dets membranforankrede domæne, der således er opløseligt, vist sig at udvise gavnlige virkninger i forskellige dyremodeller, herunder hjertesvigt, akut lungeskade og diabetisk nefropati, og så frem. rhACE2 er i øjeblikket testet i klinikken til behandling af ARDS- og COVID-19-inficerede patienter. Ved hjælp af cellekulturer og organoider viste forskere fra Karolinska Institutet i Sverige og University of British Columbia (UBC) i Canada, at ved at tilføje en genetisk modificeret variant af ACE2, kaldet humant rekombinant opløseligt angiotensin-konverterende enzym 2 (hrsACE2), COVID -19 blev forhindret i at komme ind i celler. Papiret, offentliggjort i Cell, viser, at hrsACE2 havde en dosisafhængig virkning af viral vækst af SARS-CoV-2 og var i stand til at reducere den med en faktor på 1.000 til 5.000 i cellekulturer. På trods af dets gavnlige virkninger er rhACE2 et glycosyleret protein, og dets fremstilling kræver derfor et tids- og omkostningskrævende proteinekspressionssystem med pattedyr- eller insektceller, hvilket muligvis ikke er fordelagtigt i lægemiddeludvikling og medicinsk økonomi. Selvom det var blevet rapporteret, at en immunreaktion er forbundet med den kroniske infusion af rhACE2, hvilket resulterer i nedbrydning af rhACE226, blev dette ikke observeret for B38-CAP; der var ingen antistoffer mod B38-CAP påviselige i serum fra mus infunderet med B38-CAP i 2 uger. Implantation af B38-CAP-fyldte osmotiske minipumper undertrykte signifikant Ang II-induceret hypertension i bevidste mus. påvirker pulsen. Disse resultater indikerer, at B38-CAP antagoniserer den vasopressoreffekt af Ang II. Så den principielle efterforsker forventer og foreslår, at behandling med klonede bakterielle ACE2-receptorer -lignende enzym af B38-CAP kunne være lovende COVID-19-infektion- og lungeskade, der forhindrer lægemiddel bedre end rekombinant humant ACE2 ud over brsACE2, der forventes at lokke virussen til binder sig til kopien i stedet for de faktiske celler... Det distraherer virussen fra at inficere cellerne i samme grad og bør føre til en reduktion i væksten af ​​virussen i lungerne og andre organer. En undersøgelse viste, at rekombinant B38-CAP-protein nedregulerer Ang II-niveauer i mus og modvirker Ang II-induceret hypertension, patologisk hjertehypertrofi og myokardiefibrose. En undersøgelse viste gavnlige virkninger af B38-CAP på patologien af ​​trykoverbelastningsinduceret hjertesvigt hos mus uden åbenlyse toksiciteter og også forbehandling af B38-CAP nedregulerede markant en massiv stigning i plasma Ang II-niveauer 5 minutter efter Ang II-injektion. til de aktuelt anvendte lægemidler til at hæmme Ang II-generering eller -signalering, såsom ACE-hæmmere eller angiotensin-receptorblokkere, er direkte nedmodulering af Ang II-niveauer med rhACE2-protein en af ​​de lovende kandidater til ny terapeutisk strategi ved hjerte-kar-sygdomme og andre Ang II -relaterede sygdomme, f.eks. ARDS. På den anden side, selvom masseproduktion af rhACE2 som et proteinlægemiddel koster på grund af krav om pattedyrcelleekspressionssystemer, fremstilles B38-CAP let med E. coli-ekspressionssystem og er omkostningseffektivt. Terapeutisk effekt og mindre toksicitet i muse-hjertesvigt-modeller ville berettige yderligere undersøgelse af B38-CAP eller andre mikrobielle carboxypeptidaser i sygdomsmodeller. Ydermere kan humant ACE2-lignende enzym i bakterier bane vejen for en ny strategi til at udvikle udviklingen af ​​bakterielle proteiner til bedre design og forberedelse af rekombinante proteinlægemidler. Endelig forventer hovedforskeren, at behandling med ACE2-lignende enzym i bakterien B38-CAP kan gøre den samme mekanisme som rhACE2 til at hæmme COVID-19, og den anden foreslåede mekanisme er, at ACE2-lignende enzym i bakterier B38-CAP-injektion i menneskekroppen vil udføre den samme funktion som humant ACE2, og på samme tid vil det være resistent over for COVID-spike-protein, fordi det evolutionært er for langt væk fra human ace2, og human ACE2 er en reel receptor for COVID-19, ikke ACE2-lignende enzym, og også blandt tre bakterielle carboxypeptidaser, vi testede, viste kun B38-CAP afhængighed af proteolytisk aktivitet på anionkoncentration , som er karakteristisk for ACE2-aktivitet. B38-CAP viste også pH-optimum på 7,5 ækvivalent til rhACE2. Derudover var IC50 af MLN-4760 også ækvivalent mellem rhACE2 og B38-CAP. Selvom B38-CAP udviste ret lignende proteolytisk aktivitet som rhACE2, ser der ud til at være en forskel i substratspecificitet mellem to enzymer. Så hovedforskeren forventer også, at B38-CAP ACE2-lignende enzym muligvis ikke genkendes af COVID-19 spikeprotein, men i det samme gang vil det lave den samme funktion som human ACE2 ud over at nedregulere human ACE2, som er den egentlige receptor for COVID-19

Blokering af ACE2-receptoren for COVID-19, som er dens egentlige receptorer

Isotretinoin (13cis RA) kan muligvis hæmme COVID 2019-indtrængen via nedregulering af ACE2 via handling som shRNA rettet mod ACE2-genekspression, og dette diskuteres som følger:

COVID-19-pandemien forårsaget af SARS-COV-2 har inficeret over 2.000.000 mennesker og forårsaget over 150.000 dødsfald. Et centralt cellulært værtsprotein, der kræves til virusindtrængning, er angiotensin-konverterende enzym 2 (ACE2), hvis ekspression er blevet påvist i mange væv, herunder alveolære epiteltype II-celler i lunger, mundslimhinde og tarm, hjerte, nyre, endotel og hud. ACE2-udtrykkende celler kan fungere som hjemmeceller og er tilbøjelige til SARS-CoV-2-infektion, da ACE2-receptor letter cellulær viral indgang og replikation. En undersøgelse viste, at patienter med hypertension og diabetes mellitus kan have højere risiko for SARS-CoV-2-infektion, da disse patienter ofte behandles med ACE-hæmmere (ACEI) eller angiotensin II type-I receptorblokkere (ARB), som er blevet tidligere foreslået at øge ACE2-ekspression. I en anden undersøgelse af Sinha et al, der analyserede et offentligt tilgængeligt Connectivity Map (CMAP) datasæt af præ/post transkriptomiske profiler til lægemiddelbehandling i cellelinjer for over 20.000 små molekyler, var isotretinoin den stærkeste nedregulator af ACE 2 receptorer. På den anden side fandt de 6 lægemidler i CMAP, som i øjeblikket undersøges i kliniske forsøg til behandling af COVID-19 (chloroquin, thalidomid, methylprednisolon, losartan, lopinavir og ritonavir, fra clinicaltrials.gov). ingen af ​​dem viste sig at ændre ACE2-ekspression signifikant (P>0,1) Desuden viste en anden undersøgelse, at isotretinoin er en potentiel papain-lignende protease (PLpro) hæmmer, som er et protein kodet af SARS-CoV-2 gener og betragtes som et af de proteiner, der bør målrettes i COVID-19 behandling ved at udføre målbaseret virtuel ligandscreening som Principal Investigator diskuterede før det (13cRA) er den stærkeste nedregulator af ACE2. og hovedforskeren forventer, at 13cRA kan hæmme og nedregulere ACE2-ekspression, hvilket tyder på dets terapeutiske potentiale til at forhindre indtrængen af ​​COVID 2019 til værtscellen.