Rekombinanttien bakteerien ACE2-reseptoreiden yhdistelmä – kuten B38-CAP:n entsyymi ja isotretinoiini – voisi olla lupaava hoito COVID-19-infektiolle ja sen tulehduskomplikaatioille

Tämä on pieni pilottitutkimus, jossa tutkitaan, onko olemassa mitään tehokkuussignaalia, joka oikeuttaisi suuremman vaiheen 2B kokeen, tai haittaa, joka viittaa siihen, että tällaista koetta ei pitäisi tehdä. Sen odotetaan tuottavan tilastollisesti merkittäviä tuloksia tärkeimmissä päätepisteissä. Tutkija tutkii kaikki biologiset, fysiologiset ja kliiniset tiedot määrittääkseen, onko 2B-vaiheen tutkimus perusteltu.

• Ensisijainen tehokkuusanalyysi tehdään vain potilaille, jotka saavat vähintään 4 annosta aktiivista yhdistelmälääkettä. Turvallisuusanalyysi tehdään kaikille potilaille, jotka saavat vähintään yhden annoksen aktiivista lääkettä. On suunniteltu rekisteröidään enintään 24 COVID-19-potilasta. Jokaisessa ryhmässä odotetaan olevan vähintään 12 arvioitavaa potilasta.
• Kokeellinen ryhmä: 0,4 mg/kg IV kahdesti vuorokaudessa 7 päivän ajan (sokkoutettuna) plus aerosolisoitu 13 cis-retinoiinihappo asteittain jaettuna 2 annokseen lisää muotoja 0,2 mg/kg/vrk 4 mg/kg/vrk inhaloitavana isotretinoiinihoitona 14 päivän ajan ja hoidon standardi Kontrolliryhmä: hoidon standardi Intervention kesto: enintään 14 päivää hoitoa Ei suunniteltua välianalyysiä.

Yhdistelmä-bakteeriperäisten ACE2-reseptorien - kuten B38-CAP-entsyymin ja isotretinoiinin - yhdistelmä voisi olla lupaava hoito COVID-19-infektiolle ja sen tulehduskomplikaatioille

Mahmoud ELkazzaz1

1 Kemian ja biokemian laitos, luonnontieteiden tiedekunta, Damietta University, GOEIC, Egypti.

__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Johdanto

Angiotensiinia konvertoiva entsyymi-2 (ACE2) -reseptorit välittävät kolmen koronaviruskannan: SARS-CoV, NL63 ja SARS-CoV-2 pääsyn soluun. ACE2-reseptorit ovat kaikkialla läsnä ja ilmentyvät laajalti sydämessä, verisuonissa, suolistossa, keuhkoissa (erityisesti tyypin 2 pneumosyyteissä ja makrofageissa), munuaisissa, kiveksissä ja aivoissa. ACE2 on enimmäkseen sitoutunut solukalvoihin ja vain harvoin läsnä verenkierrossa liukoisessa muodossa. Kalvoon sitoutuneen ja liukoisen ACE2:n tärkeä terveellinen tehtävä on angiotensiini II:n hajottaminen angiotensiini 1-7:ksi. Näin ollen ACE2-reseptorit rajoittavat useita haitallisia vaikutuksia, jotka johtuvat angiotensiini II:n sitoutumisesta AT1-reseptoreihin, joita ovat vasokonstriktio, lisääntynyt tulehdus ja tromboosi. Angiotensiini 1-7:n lisääntynyt tuotanto laukaisee myös vastasäätelyä suojaavia vaikutuksia sitoutumalla G-proteiiniin kytkettyihin Mas-reseptoreihin. Valitettavasti SARS-CoV2:n pääsy soluihin kalvofuusion kautta heikentää huomattavasti ACE2-reseptoreja, jolloin näiden reseptorien katalyyttinen vaikutus menetetään kalvon ulkoisessa kohdassa. Lisääntynyt keuhkotulehdus ja koagulaatio on raportoitu voimistuneiden ja vastakkaisten angiotensiini II -vaikutusten ei-toivottuina vaikutuksina ACE→Angiotensiini II→AT1-reseptoriakselin kautta. SARS-CoV-2-tartunnan saaneiden potilaiden kliiniset raportit osoittavat, että useilla infektioon ja taudin vakavuuteen liittyvillä piirteillä (eli vanhempi ikä, verenpainetauti, diabetes, sydän- ja verisuonisairaus) on vaihtelevaasteinen ACE2-puutos. Ehdotamme, että virusinvaasion aiheuttama ACE2:n heikkeneminen voi olla erityisen haitallista ihmisille, joilla on edellä mainittuihin tiloihin liittyvä ACE2-puutos. Ylimääräinen ACE2-puutos virusinvaasion jälkeen saattaa vahvistaa "haitallisen" ACE→Angiotensiini II→AT1-reseptoriakselin ja "suojaavan" ACE2→Angiotensiini1-7→Mas-reseptoriakselin välistä säätelyhäiriötä. Keuhkoissa tällainen säätelyhäiriö suosii tulehduksellisten ja tromboottisten prosessien etenemistä, jonka laukaisee paikallinen angiotensiini II -hyperaktiivisuus, jota angiotensiini 1-7 ei vastusta. Tässä tilanteessa rekombinantti brACE2 voisi olla lupaava terapeuttinen lähestymistapa potilailla, joilla on SARS-CoV-2-infektio.

Reniini-angiotensiinijärjestelmän (RAS) pelastaminen B38-CAP ACE2:lla, joka on bakteeriperäinen ACE2:n kaltainen entsyymi

B38-CAP:sta johdetun ACE2:n kaltaisen entsyymin odotetut hyödyt aikaisempien tutkimustulosten perusteella osoittavat, että B38-CAP:sta johdettu ACE2:n kaltainen entsyymi suorittaa saman toiminnon kuin ihmisen ACE2 ja samalla se on resistentti COVID-piikin proteiinille, koska evoluution mukaan se on liian kaukana ihmisen ace2:sta ja ihmisen ACE2 on todellinen COVID-19:n reseptori, ei ACE2:n kaltainen entsyymi, ja tästä keskustellaan seuraavasti:

B38-CAP on bakteeriperäinen ACE2:n kaltainen entsyymi, joka estää kohonnutta verenpainetta ja sydämen vajaatoimintaa. Angiotensiinia konvertoiva entsyymi 2 (ACE2) on kriittisesti mukana kardiovaskulaarisessa fysiologiassa ja patologiassa, ja sitä arvioidaan tällä hetkellä kliinisesti akuutin keuhkojen vajaatoiminnan hoitoon. Tässä osoitamme, että B38-CAP, karboksipeptidaasi, joka on peräisin Paenibacillus sp. B38 on ACE2:n kaltainen entsyymi, joka alentaa angiotensiini II -tasoja hiirillä. Proteiinin 3D-rakenneanalyysissä B38-CAP-homologilla on rakenteellista samankaltaisuutta nisäkkään ACE2:n kanssa alhaisella sekvenssi-identtisyydellä. Rekombinantti B38-CAP-proteiini katalysoi in vitro angiotensiini II:n konversiota angiotensiini 1-7:ksi sekä muiksi tunnetuiksi ACE2-kohdepeptideiksi. Hoito B38-CAP:lla tukahdutti angiotensiini II:n aiheuttaman verenpaineen, sydämen hypertrofian ja fibroosin hiirillä. Lisäksi B38-CAP esti paineen ylikuormituksen aiheuttamaa patologista hypertrofiaa, sydänlihasfibroosia ja sydämen toimintahäiriötä hiirillä. Tietomme tunnistavat bakteerien B38-CAP:n ACE2:n kaltaiseksi karboksipeptidaasiksi, mikä osoittaa, että evoluutio on muovannut bakteerien karboksipeptidaasin ihmisen ACE2:n kaltaiseksi entsyymiksi. Bakteeritekniikkaa voitaisiin hyödyntää parempien proteiinilääkkeiden suunnittelussa verenpainetautiin ja sydämen vajaatoimintaan. Päinvastoin, hoidon rekombinantilla ihmisen ACE2-proteiinilla (rhACE2), josta puuttuu sen kalvoon ankkuroitu domeeni, joka on siten liukoinen, on osoitettu olevan hyödyllisiä erilaisissa eläinmalleissa, mukaan lukien sydämen vajaatoiminta, akuutti keuhkovaurio ja diabeettinen nefropatia ja niin edelleen. eteenpäin. rhACE2:ta testataan tällä hetkellä klinikalla ARDS- ja COVID-19-tartunnan saaneiden potilaiden hoitoon. Ruotsalaisen Karolinska-instituutin ja Kanadan Brittiläisen Kolumbian yliopiston (UBC) tutkijat osoittivat soluviljelmiä ja organoideja käyttämällä, että lisäämällä geneettisesti muunneltua ACE2-varianttia, nimeltään ihmisen rekombinantti liukoinen angiotensiinia konvertoiva entsyymi 2 (hrsACE2), COVID -19 estettiin pääsemästä soluihin. Cell-julkaisussa julkaistu paperi osoittaa, että hrsACE2:lla oli annosriippuvainen vaikutus SARS-CoV-2-viruksen kasvuun ja se kykeni vähentämään sitä kertoimella 1 000 - 5 000 soluviljelmissä. Hyödyllisistä vaikutuksistaan ​​huolimatta rhACE2 on glykosyloitunut proteiini ja siksi sen valmistaminen vaatii aikaa ja kustannuksia vievän proteiinin ilmentämisjärjestelmän nisäkäs- tai hyönteissoluilla, mikä ei välttämättä ole edullista lääkekehityksessä ja lääketaloudessa. Vaikka on raportoitu, että immuunivaste liittyy rhACE2:n krooniseen infuusioon, mikä johtaa rhACE226:n hajoamiseen, tätä ei havaittu B38-CAP:lle; B38-CAP:n vastaisia ​​vasta-aineita ei ollut havaittavissa B38-CAP:llä 2 viikon ajan infusoitujen hiirten seerumissa. B38-CAP:lla täytettyjen osmoottisten minipumppujen istuttaminen tukahdutti merkittävästi Ang II:n aiheuttamaa verenpainetautia tajuissaan olevilla hiirillä. vaikuttaa sykeen. Nämä tulokset osoittavat, että B38-CAP antagonisoi Ang II:n vasopressorivaikutusta. Niinpä periaatetutkija odottaa ja ehdottaa, että hoito kloonatuilla bakteeri-ACE2-reseptoreilla - kuten B38-CAP:n entsyymi - voisi olla lupaava COVID-19-infektiota ja keuhkovaurioita ehkäisevä lääke paremmin kuin rekombinantti ihmisen ACE2 brsACE2:n lisäksi, jonka odotetaan houkuttelevan viruksen kiinnittyy kopioon todellisten solujen sijaan… Se häiritsee viruksen huomion tartuttamasta soluja samassa määrin ja sen pitäisi johtaa viruksen kasvun hidastumiseen keuhkoissa ja muissa elimissä. Tutkimus osoitti, että rekombinantti B38-CAP-proteiini alentaa Ang II -tasoja hiirissä ja estää Ang II:n aiheuttamaa verenpainetautia, patologista sydämen liikakasvua ja sydänlihasfibroosia. Tutkimus osoitti B38-CAP:n suotuisat vaikutukset paineen ylikuormituksen aiheuttaman sydämen vajaatoiminnan patologiaan hiirillä ilman ilmeistä toksisuutta, ja myös B38-CAP:n esikäsittely vähensi merkittävästi plasman Ang II -tasojen massiivista nousua 5 minuuttia Ang II -injektion jälkeen. Nykyisin käytössä oleviin Ang II:n sukupolven tai signaloinnin estämiseen tarkoitettuihin lääkkeisiin, kuten ACE:n estäjiin tai angiotensiinireseptorin salpaajiin, rhACE2-proteiinin aiheuttama Ang II -tasojen suora alentaminen on yksi lupaavista ehdokkaista uudelle terapeuttiselle strategialle sydän- ja verisuonitautien ja muiden Ang II:n hoidossa. - liittyvät sairaudet, esim. ARDS. Toisaalta, vaikka rhACE2:n massatuotanto proteiinilääkkeenä maksaa nisäkässolujen ilmentämisjärjestelmien vaatimuksen vuoksi, B38-CAP on helppo valmistaa E. coli -ilmentämisjärjestelmällä ja se on kustannustehokasta. Terapeuttinen tehokkuus ja pienempi toksisuus hiiren sydämen vajaatoimintamalleissa edellyttävät B38-CAP:n tai muiden mikrobien karboksipeptidaasien lisätutkimuksia sairausmalleissa. Lisäksi ihmisen ACE2:n kaltainen entsyymi bakteereissa saattaa tasoittaa tietä uudelle strategialle suunnitella bakteeriproteiinien kehitystä rekombinanttiproteiinilääkkeiden parempaan suunnitteluun ja valmistukseen. Lopuksi päätutkija odottaa, että hoito ACE2:n kaltaisella entsyymillä bakteereissa B38-CAP voi Tee sama rhACE2:n mekanismi COVID-19:n estämisessä ja toinen ehdotettu mekanismi on, että ACE2:n kaltainen entsyymi bakteereissa B38-CAP-injektio ihmiskehoon suorittaa saman toiminnon kuin ihmisen ACE2 ja samalla se on vastustuskykyinen COVID-piikkiproteiini, koska se on evoluutionistisesti liian kaukana ihmisen ace2:sta ja ihmisen ACE2 on todellinen COVID-19:n reseptori, ei ACE2:n kaltainen entsyymi. Myös kolmesta testaamastamme bakteerikarboksipeptidaasista vain B38-CAP osoitti proteolyyttisen aktiivisuuden riippuvuutta anionipitoisuudesta. , mikä on ominaista ACE2-aktiivisuudelle. B38-CAP osoitti myös pH-optimiarvon 7,5, joka vastaa rhACE2:ta. Lisäksi MLN-4760:n IC50 oli myös ekvivalentti rhACE2:n ja B38-CAP:n välillä. Vaikka B38-CAP osoitti melko samanlaista proteolyyttistä aktiivisuutta kuin rhACE2, kahden entsyymin välillä näyttää olevan eroa substraattispesifisyydessä. Joten päätutkija olettaa myös, että COVID-19-piikkiproteiini ei ehkä tunnista B38-CAP:n ACE2:n kaltaista entsyymiä, mutta se on sama. ajan kuluessa se tekee saman toiminnon ihmisen ACE2:lla sen lisäksi, että se säätelee ihmisen ACE2:ta, joka on todellinen COVID-19:n reseptori.

Estää COVID-19:n ACE2-reseptorin, joka on sen todelliset reseptorit

Isotretinoiini (13cis RA) saattaa kyetä estämään COVID 2019:n sisäänpääsyn ACE2:n alasäätelyn kautta sellaisilla toimilla, kuten shRNA, joka kohdistuu ACE2-geenin ilmentymiseen, ja tästä keskustellaan seuraavasti:

SARS-COV-2:n aiheuttama COVID-19-pandemia on tartuttanut yli 2 000 000 ihmistä ja aiheuttanut yli 150 000 kuolemaa. Keskeinen isäntäsoluproteiini, jota tarvitaan viruksen sisäänpääsyyn, on angiotensiiniä konvertoiva entsyymi 2 (ACE2), jonka ilmentymistä on osoitettu monissa kudoksissa, mukaan lukien keuhkojen, suun limakalvojen ja suolistossa, sydämessä, munuaisissa, endoteelissä ja ihossa olevissa alveolaarisissa epiteelisoluissa. ACE2:ta ilmentävät solut voivat toimia kotisoluina ja ovat alttiita SARS-CoV-2-infektiolle, koska ACE2-reseptori helpottaa viruksen pääsyä soluun ja replikaatiota. Tutkimus osoitti, että potilailla, joilla on verenpainetauti ja diabetes mellitus, saattaa olla suurempi riski saada SARS-CoV-2-infektio, koska näitä potilaita hoidetaan usein ACE:n estäjillä (ACEI) tai angiotensiini II tyypin I reseptorin salpaajilla (ARB). aiemmin ehdotettu lisäävän ACE2:n ilmentymistä. Toisessa tutkimuksessa Sinha et al, jotka analysoivat julkisesti saatavilla olevaa Connectivity Map (CMAP) -tietosarjaa transkriptioiden edeltävistä ja jälkeisistä profiileista lääkehoitoa varten solulinjoissa yli 20 000 pienelle molekyylille, isotretinoiini oli vahvin ACE 2 -reseptorien säätelijä. Toisaalta he löysivät CMAP:sta kuusi lääkettä, joita tutkitaan parhaillaan COVID-19:n hoitoon tarkoitetuissa kliinisissä tutkimuksissa (klorokiini, talidomidi, metyyliprednisoloni, losartaani, lopinaviiri ja ritonaviiri, Clinictrials.gov), yhdenkään niistä ei havaittu merkittävästi muuttavan ACE2:n ilmentymistä (P>0,1) Lisäksi toinen tutkimus osoitti, että isotretinoiini on mahdollinen papaiinin kaltainen proteaasin (PLpro) inhibiittori, joka on SARS-CoV-2-geenien koodaama proteiini, jota pidetään yhtenä proteiineista, johon COVID-19-hoidossa tulisi kohdistua kohdepohjaisen virtuaalisen hoidon avulla. ligandiseulonta, kuten päätutkija keskusteli aiemmin, (13cRA) on vahvin ACE2:n alasäätäjä. ja päätutkija odottaa, että 13cRA voi estää ja vaimentaa ACE2:n ilmentymistä, mikä viittaa sen terapeuttiseen potentiaaliin estää COVID 2019:n pääsyn isäntäsoluun.