La combinazione di recettori batterici ricombinanti ACE2, come l'enzima di B38-CAP e isotretinoina, potrebbe essere un trattamento promettente per l'infezione da COVID-19 e le sue complicanze infiammatorie

Questo è un piccolo studio pilota che indaga se esiste un segnale di efficacia che giustifichi uno studio di Fase 2B più ampio o qualsiasi danno che suggerisca che tale studio non dovrebbe essere fatto. Si prevede che produrrà risultati statisticamente significativi nei principali endpoint. Il ricercatore esaminerà tutti i dati biologici, fisiologici e clinici per determinare se è giustificato uno studio di fase 2B.

• L'analisi di efficacia primaria sarà effettuata solo su pazienti che ricevono almeno 4 dosi di farmaci combinati attivi. L'analisi di sicurezza sarà effettuata su tutti i pazienti che ricevono almeno una dose di farmaco attivo. Si prevede di arruolare più o meno di 24 soggetti con COVID-19. Si prevede di avere almeno 12 pazienti valutabili in ciascun gruppo.
• Gruppo sperimentale: 0,4 mg/kg EV BID per 7 giorni (non in cieco) più Acido retinoico 13 cis aerosol in forma graduale in 2 dosi divise aumenta da 0,2 mg/kg/giorno a 4 mg/kg/giorno come terapia con isotretinoina per via inalatoria per 14 giorni e standard di cura Gruppo di controllo: standard di cura Durata dell'intervento: fino a 14 giorni di terapia Nessuna analisi intermedia pianificata.

La combinazione di recettori batterici ricombinanti ACE2 - enzima simile a B38-CAP e isotretinoina potrebbe essere un trattamento promettente per l'infezione da COVID-19 e le sue complicanze infiammatorie

Mahmoud ELkazzaz1

1Dipartimento di chimica e biochimica, Facoltà di Scienze, Damietta University, GOEIC, Egitto.

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introduzione

I recettori dell'enzima di conversione dell'angiotensina-2 (ACE2) mediano l'ingresso nella cellula di tre ceppi di coronavirus: SARS-CoV, NL63 e SARS-CoV-2. I recettori ACE2 sono ubiquitari e ampiamente espressi nel cuore, nei vasi, nell'intestino, nei polmoni (in particolare nei pneumociti e nei macrofagi di tipo 2), nei reni, nei testicoli e nel cervello. L'ACE2 è per lo più legato alle membrane cellulari e solo scarsamente presente nella circolazione in forma solubile. Un'importante funzione salutare dell'ACE2 legato alla membrana e solubile è la degradazione dell'angiotensina II in angiotensina 1-7. Di conseguenza, i recettori ACE2 limitano diversi effetti dannosi derivanti dal legame dell'angiotensina II ai recettori AT1, che includono vasocostrizione, aumento dell'infiammazione e trombosi. L'aumento della generazione di angiotensin1-7 innesca anche effetti protettivi controregolatori attraverso il legame ai recettori Mas accoppiati a proteine ​​G. Sfortunatamente, l'ingresso di SARS-CoV2 nelle cellule attraverso la fusione della membrana riduce notevolmente i recettori ACE2, con perdita dell'effetto catalitico di questi recettori nel sito esterno della membrana. L'aumento dell'infiammazione polmonare e della coagulazione è stato riportato come effetto indesiderato degli effetti potenziati e incontrastati dell'angiotensina II attraverso l'asse del recettore ACE→Angiotensina II→AT1. Rapporti clinici di pazienti infetti da SARS-CoV-2 mostrano che diverse caratteristiche associate all'infezione e alla gravità della malattia (ad esempio, età avanzata, ipertensione, diabete, malattie cardiovascolari) condividono un grado variabile di carenza di ACE2. Suggeriamo che la down-regulation di ACE2 indotta dall'invasione virale possa essere particolarmente dannosa nelle persone con carenza di ACE2 al basale associata alle condizioni di cui sopra. L'ulteriore carenza di ACE2 dopo l'invasione virale potrebbe amplificare la disregolazione tra l'asse "avverso" del recettore ACE → Angiotensina II → AT1 e l'asse "protettivo" del recettore ACE2 → Angiotensin1-7 → Mas. Nei polmoni, tale disregolazione favorirebbe la progressione dei processi infiammatori e trombotici innescati dall'iperattività locale dell'angiotensina II incontrastata dall'angiotensina1-7. In questo contesto, il brACE2 ricombinante potrebbe essere promettente approccio terapeutico nei pazienti con infezione da SARS-CoV-2.

Salvataggio del sistema renina-angiotensina (RAS) da parte di B38-CAP ACE2 che è un enzima simile all'ACE2 derivato dai batteri

I benefici attesi dall'enzima ACE2-simile derivato da B38-CAP in base a dati di ricerca precedenti mostrano che l'enzima simile a ACE2 derivato da B38-CAP svolgerà la stessa funzione dell'ACE2 umano e allo stesso tempo sarà resistente alla proteina COVID-spike perché evolutivo è troppo lontano dall'ace2 umano e l'ACE2 umano è un vero recettore di COVID -19 non ACE2 come l'enzima e questo discusso come segue:

B38-CAP è un enzima simile all'ACE2 derivato da batteri che sopprime l'ipertensione e la disfunzione cardiaca L'enzima di conversione dell'angiotensina 2 (ACE2) è coinvolto in modo critico nella fisiologia e nella patologia cardiovascolare ed è attualmente valutato clinicamente per il trattamento dell'insufficienza polmonare acuta. Qui mostriamo che il B38-CAP, una carbossipeptidasi derivata da Paenibacillus sp. B38, è un enzima simile all'ACE2 per diminuire i livelli di angiotensina II nei topi. Nell'analisi della struttura 3D delle proteine, l'omologo B38-CAP condivide la somiglianza strutturale con l'ACE2 dei mammiferi con identità a bassa sequenza. In vitro, la proteina ricombinante B38-CAP ha catalizzato la conversione dell'angiotensina II in angiotensina 1-7, così come altri peptidi bersaglio ACE2 noti. Il trattamento con B38-CAP ha soppresso l'ipertensione indotta da angiotensina II, l'ipertrofia cardiaca e la fibrosi nei topi. Inoltre, B38-CAP ha inibito l'ipertrofia patologica indotta da sovraccarico di pressione, la fibrosi miocardica e la disfunzione cardiaca nei topi. I nostri dati identificano la B38-CAP batterica come una carbossipeptidasi simile all'ACE2, indicando che l'evoluzione ha modellato una carbossipeptidasi batterica in un enzima simile all'ACE2 umano. L'ingegneria batterica potrebbe essere utilizzata per progettare farmaci proteici migliorati per l'ipertensione e l'insufficienza cardiaca. Al contrario, è stato dimostrato che il trattamento con la proteina ACE2 umana ricombinante (rhACE2), che è priva del suo dominio ancorato alla membrana e quindi solubile, mostra effetti benefici in vari modelli animali tra cui insufficienza cardiaca, danno polmonare acuto e nefropatia diabetica, e così via. rhACE2 è attualmente testato in clinica per il trattamento di pazienti con infezione da ARDS e COVID-19. Utilizzando colture cellulari e organoidi, i ricercatori del Karolinska Institute in Svezia e dell'Università della British Columbia (UBC) in Canada, hanno dimostrato che aggiungendo una variante geneticamente modificata di ACE2, chiamata enzima di conversione dell'angiotensina solubile ricombinante umano 2 (hrsACE2), COVID -19 è stato impedito di entrare nelle celle. Il documento, pubblicato su Cell, mostra che hrsACE2 ha avuto un effetto dose-dipendente sulla crescita virale di SARS-CoV-2 ed è stato in grado di ridurlo di un fattore da 1.000 a 5.000 nelle colture cellulari. Nonostante i suoi effetti benefici, rhACE2 è una proteina glicosilata e quindi la sua preparazione richiede un sistema di espressione proteica dispendioso in termini di tempo e costi con cellule di mammiferi o insetti, che potrebbe non essere vantaggioso nello sviluppo di farmaci e nell'economia medica Sebbene fosse stato segnalato che una risposta immunitaria è associato all'infusione cronica di rhACE2 con conseguente degradazione di rhACE226, ciò non è stato osservato per B38-CAP; non c'erano anticorpi contro B38-CAP rilevabili nel siero di topi infusi con B38-CAP per 2 settimane. L'impianto di mini-pompe osmotiche riempite con B38-CAP ha soppresso significativamente l'ipertensione indotta da Ang II nei topi coscienti. influenzando la frequenza cardiaca. Questi risultati indicano che B38-CAP antagonizza l'effetto vasopressore di Ang II. Quindi il ricercatore principale si aspetta e suggerisce che il trattamento con i recettori batterici ACE2 clonati, come l'enzima B38-CAP, potrebbe promettere l'infezione da COVID-19 e prevenire il danno polmonare meglio dell'ACE2 umano ricombinante in aggiunta a brsACE2, che dovrebbe attirare il virus a attaccarsi alla copia invece che alle cellule effettive… Distrae il virus dall'infettare le cellule nella stessa misura e dovrebbe portare a una riduzione della crescita del virus nei polmoni e in altri organi. Uno studio ha dimostrato che la proteina ricombinante B38-CAP riduce i livelli di Ang II nei topi e antagonizza l'ipertensione indotta da Ang II, l'ipertrofia cardiaca patologica e la fibrosi miocardica. Uno studio ha mostrato gli effetti benefici di B38-CAP sulla patologia dell'insufficienza cardiaca indotta da sovraccarico di pressione nei topi senza tossicità evidenti e anche il pretrattamento di B38-CAP ha notevolmente ridotto un massiccio aumento dei livelli plasmatici di Ang II a 5 minuti dopo l'iniezione di Ang II. ai farmaci attualmente utilizzati per inibire la generazione o la segnalazione di Ang II, come gli ACE-inibitori o i bloccanti del recettore dell'angiotensina, la down-modulazione diretta dei livelli di Ang II da parte della proteina rhACE2 è uno dei candidati promettenti per una nuova strategia terapeutica nelle malattie cardiovascolari e altri Ang II malattie correlate, ad es. SINDROME DA DISTRESS RESPIRATORIO ACUTO. D'altra parte, sebbene la produzione di massa di rhACE2 come farmaco proteico costi a causa dei requisiti dei sistemi di espressione delle cellule di mammifero, B38-CAP è facilmente preparabile con il sistema di espressione di E. coli ed è conveniente. L'efficacia terapeutica e la minore tossicità nei modelli di insufficienza cardiaca del topo richiederebbero ulteriori indagini su B38-CAP o altre carbossipeptidasi microbiche nei modelli di malattia. Inoltre, l'enzima umano ACE2-simile nei batteri potrebbe aprire la strada a una nuova strategia per ingegnerizzare l'evoluzione delle proteine ​​batteriche per una migliore progettazione e preparazione di farmaci proteici ricombinanti. fare lo stesso meccanismo di rhACE2 nell'inibire COVID -19 e l'altro meccanismo suggerito è che l'enzima simile all'ACE2 nei batteri B38-CAP iniettato nel corpo umano svolgerà la stessa funzione dell'ACE2 umano e allo stesso tempo sarà resistente a Proteina COVID-spike perché evolutiva è troppo lontana dall'ace2 umano e l'ACE2 umano è un vero recettore di COVID -19 non ACE2 come l'enzima e Inoltre tra le tre carbossipeptidasi batteriche che abbiamo testato, solo B38-CAP ha mostrato dipendenza dell'attività proteolitica dalla concentrazione di anioni , che è caratteristico dell'attività ACE2. B38-CAP ha anche mostrato un pH ottimale di 7,5 equivalente a rhACE2. Inoltre, anche IC50 di MLN-4760 era equivalente tra rhACE2 e B38-CAP. Sebbene B38-CAP abbia mostrato un'attività proteolitica abbastanza simile a rhACE2, sembra esserci una differenza nella specificità del substrato tra due enzimi. Quindi, il ricercatore principale si aspetta anche che l'enzima simile a B38-CAP ACE2 possa non essere riconosciuto dalla proteina spike COVID-19 ma nello stesso tempo farà la stessa funzione dell'ACE2 umano oltre alla regolazione verso il basso dell'ACE2 umano che è il vero recettore di COVID -19

Blocco del recettore ACE2 di COVID -19 che ne è il vero recettore

L'isotretinoina (13cis RA) potrebbe essere in grado di inibire l'ingresso di COVID 2019 tramite la regolazione negativa di ACE2 tramite un'azione come lo shRNA che mira all'espressione del gene ACE2 e questo è discusso come segue:

La pandemia di COVID-19 causata da SARS-COV-2 ha infettato oltre 2.000.000 di persone provocando oltre 150.000 morti. Una proteina cellulare ospite chiave richiesta per l'ingresso del virus è l'enzima di conversione dell'angiotensina 2 (ACE2) la cui espressione è stata dimostrata in molti tessuti, comprese le cellule epiteliali alveolari di tipo II nei polmoni, nella mucosa orale e nell'intestino, nel cuore, nei reni, nell'endotelio e nella pelle. Le cellule che esprimono ACE2 possono agire come cellule domestiche e sono soggette all'infezione da SARS-CoV-2 poiché il recettore ACE2 facilita l'ingresso e la replicazione virale cellulare. Uno studio ha dimostrato che i pazienti con ipertensione e diabete mellito possono essere a più alto rischio di infezione da SARS-CoV-2, poiché questi pazienti sono spesso trattati con ACE-inibitori (ACEI) o bloccanti del recettore di tipo I dell'angiotensina II (ARB), che sono stati precedentemente suggerito per aumentare l'espressione ACE2. In un altro studio di Sinha et al., che ha analizzato un set di dati CMAP (Connectivity Map) pubblicamente disponibile di profili pre/post trascrittomici per il trattamento farmacologico in linee cellulari per oltre 20.000 piccole molecole, l'isotretinoina era il più potente down-regulator dei recettori ACE 2. D'altra parte, hanno trovato 6 farmaci in CMAP che sono attualmente studiati in studi clinici per il trattamento di COVID-19 (clorochina, talidomide, metilprednisolone, losartan, lopinavir e ritonavir, da clinicaltrials.gov), nessuno dei quali è stato trovato per alterare significativamente l'espressione di ACE2 ( P > 0,1) Inoltre, un altro studio ha dimostrato che l'isotretinoina è un potenziale inibitore della proteasi simile alla papaina (PLpro), che è una proteina codificata dai geni SARS-CoV-2 e considerata una delle proteine ​​che dovrebbero essere prese di mira nel trattamento COVID-19 mediante l'esecuzione di virtualizzazione basata su target lo screening del ligando come Principal Investigator discusso prima (13cRA) è il più forte down-regulator di ACE2. e il ricercatore principale si aspetta che 13cRA possa inibire e sottoregolare l'espressione di ACE2, suggerendo il suo potenziale terapeutico nel prevenire l'ingresso di COVID 2019 nella cellula ospite.