Prognostická hodnota CTC rakoviny jater izolovaných na nové mikrofluidní platformě

V Číně je výskyt hepatocelulárního karcinomu (HCC) na čtvrtém místě a úmrtnost na druhém místě. Méně než 20 % pacientů bylo schopno podstoupit kurativní resekční terapii. Většina ostatních pacientů s HCC má velmi špatnou prognózu, pouze chemická embolizace, ablační léčba nebo systémová léčba a efekt léčby je omezený. Pro včasnou diagnostiku, léčbu, předpověď prognózy a hodnocení léčebné odpovědi u HCC jsou zapotřebí účinné markery. V současnosti je alfa-fetoprotein (AFP) nejčastějším markerem HCC, který lze využít pro její diagnostiku a prognózu pacienta. AFP má však menší senzitivitu v diagnostice HCC. I když některé další markery, jako je heteromer AFP, abnormální protrombin, mají v diagnostice HCC také roli, v klinické praxi se příliš nepoužívají. Jaterní biopsie pomáhá přímo vyhodnotit molekulární biologii nádoru, má však riziko krvácení a diseminace nádoru, což se v současnosti v diagnostice HCC používá jen zřídka. Navíc biopsie jaterní punkce kvůli heterogenitě nádoru nemusí adekvátně odrážet celkovou charakteristiku nádoru.

Tekutá biopsie může být použita v různých aspektech diagnostiky, detekce a léčby nádorů, včetně cirkulujících nádorových buněk, cirkulující nádorové DNA, cirkulující miRNA, metabolitů atd. Cirkulující nádorové buňky (cirkulující nádorové buňky, CTC) ze skupiny nádorů do cirkulujícího systému nádorových buněk, je klíčovým faktorem nádorových metastáz. Většina CTC může zemřít na anoikizu, imunitní útok nebo střihový stres. Aby se CTC přizpůsobily prostředí, procházejí řadou změn, jako je epiteliálně-mezenchymální přechod (EMT). Nádorové buňky podléhají EMT a ztrácejí markery epiteliálních buněk a získávají rysy stromálních buněk. CTC jsou tedy skupinou buněk odvozených z různých oblastí nádorové tkáně, které jsou heterogenní a hrají kritickou roli v progresi nádoru. CTC jsou nejen minimálně invazivní, ale mohou také odrážet heterogenitu nádorové tkáně. CTC přenášejí genomické informace z primární nádorové tkáně, které mohou nepřímo odrážet informace o genové mutaci, variaci počtu kopií a zatížení nádorovými mutacemi v nádorové tkáni prostřednictvím celogenomového sekvenování CTC, což pomáhá lékařům vypracovat plán léčby. Předběžné studie například ukázaly, že kolísání počtu kopií v CTC má vysokou shodu s primárními tkáněmi HCC.

CTC byly rozsáhle studovány u mnoha solidních nádorů. Například u pacientů s metastatickým karcinomem prostaty může počet CTC přesně předpovědět prognózu pacientů a odrážet léčbu. Vyšetření HER2-pozitivních CTC buněk u pacientek s karcinomem prsu pomáhá upřesnit určený léčebný režim pacientky. U pacientů s chirurgickou resekcí HCC však byl počet CTC spojen s vaskulární invazí, hladinou AFP, stádiem nádoru, progresí nádoru a špatnou prognózou pacienta. Nedávno se ukázalo, že pooperační adjuvantní TACE je schopna prodloužit dobu přežití pacientů po resekci HCC s předoperačním EpCAM-pozitivním CTC, bez signifikantního efektu u CTC-negativních pacientů. Počet CTC byl však minimální a heterogenita existovala. Existuje mnoho omezení pro detekci CTC a jak přesně detekovat CTC je stále problém, který nás trápí. V současnosti používaná platforma pro izolaci CTC je založena primárně na markerech nádorových buněk, biofyzikálních vlastnostech nebo strategiích bez obohacení. Izolace na základě nádorových povrchových markerů byla tříděna pomocí specifických protilátek: leukocyty byly odstraněny z leukocytových povrchových markerů (jako je CD45), tj. negativní třídění; CTC byly separovány z povrchových markerů nádorových buněk (EpCAM, ASGPR, CK), tzn. např. pozitivní třídění. Limitací tohoto přístupu je skutečnost, že výběr markerů neodráží heterogenitu nádoru a snižuje buněčnou aktivitu. Separační metody založené na buněčném objemu, elasticitě a vodivosti CTC, jako je mikrofiltrace, gradientová centrifugace a inerciální fokus, se vyhýbají omezením spojeným s použitím povrchových markerů pro separaci, zatímco mají malý vliv na buněčnou aktivitu. Bez obohacovacích metod lze pomocí vysokorychlostního fluorescenčního zobrazování rozlišit CTC přímo v krvi pacientů.

Systém detekce cirkulujících nádorových buněk CTC-100, který používá Shenzhen Jingyi Medical Laboratory, byl přihlášen k evidenci zdravotnických prostředků Shenzhen třídy I (číslo záznamu: č. 20190047) a je na trhu. Systém je schopen efektivně zachytit obohacený CTC. Pro realizaci screeningu se spoléhá hlavně na princip inerciálního zaostřování mikrofluidního čipu a elastické fyzikální vlastnosti. Toto zařízení činí tekutinu laminární v přímém kanálu, tekutina v blízkosti stěny kanálu je nejnižší, zatímco maximální rychlost tekutiny je uprostřed kanálu. Toto rozložení rychlosti proudění vytváří gradient smykové síly a vyvolává výsledný zdvih, který tlačí částice ke stěně. Když se pohybuje blízko stěny kanálku, zdvih vyvolaný stěnou kanálku opět tlačí částice pryč od stěny kanálku. Obě vztlakové síly v opačných směrech se nazývají inerciální vztlak, tato síla působí na částice, uvede je do rovnovážné polohy. Částice se tedy soustředí na stabilní místo a tvoří soustředěný tok. Buněčné částice migrují s migrací kapaliny v mikrofluidních čipových kanálech, kvůli různé velikosti a elasticitě CTC a bílých krvinek, nakonec se zaměřují na různé rovnovážné polohy, čímž je dosaženo screeningového efektu. Testované nádorové buňky mohou identifikovat své povrchové glykochemické charakteristiky a biologické charakteristiky (EpCAM, PDL1, VEGF atd.) a nakonec dosáhnout vysoké citlivosti a specifického CTC screeningu a identifikace. Naše preklinické studie ukázaly, že počet CTC testovaných touto technikou byl významně vyšší u pacientů s rakovinou jater než u cirhózy a zdravých pacientů a byl pozitivně spojen s jaterní vaskulární invazí a velikostí nádoru (102 rakoviny jater, 43 cirhózy a 10 zdravých pacientů) . Míra detekce této techniky byla 100 % u pacientů s HCC a 64,7 % buněk detekovaných v CTC bylo EpCAM negativních. Celogenomové sekvenování zjistilo, že genové mutace v CTC byly konzistentní s odpovídající rakovinnou tkání (5 vzorků CTC a odpovídající chirurgická resekční tkáň), což naznačuje, že CTC mohou odrážet informace, jako jsou genové mutace v rakovinné tkáni.

Tato studie si klade za cíl izolovat CTC v periferní žilní krvi pacientů s rakovinou jater pomocí mikrofluidního zařízení založeného na principu inerciálního fokusování, určit vztah mezi počtem CTC a prognózou pacienta a léčebnou odpovědí, detekovat mutace, variace počtu kopií a zatížení mutací v buňkách CTC a odpovídající tkáně využívající technologii sekvenování jednobuněčného celého genomu a využívat bioinformatickou analýzu heterogenity CTC a jejího vztahu s klinickým výsledkem. Kromě toho byla kultura CTC in vitro zkoumána kulturou organoidů nebo sférickou kulturou za účelem získání buněčných linií CTC k odhalení metastatických mechanismů HCC. Partnerem tohoto projektu je společnost Cellomics International Limited, která by pro tento projekt mohla poskytnout třídič buněk Cellomics CTC-100 a související spotřební materiál. Bude odebrána periferní žilní krev od asi 300 pacientů s počáteční rakovinou jater a CTC buňky budou tříděny v 8 ml každého pacienta a typizovány podle exprese proteinu. Budou shromážděna klinická data, účinek léčby a doba přežití pacientů a nakonec bude analyzován vztah mezi počtem CTC a podskupinou s léčebnou odpovědí a prognózou pacienta. Odhalení genomických charakteristik CTC HCC poskytuje nový základ pro přesnou léčbu HCC. Nové diagnostické markery pro Hcancer byly nalezeny čipem expresního spektra miRNA a metabolomickým testováním. Předběžně byly zkoumány kultivační metody in vitro a buněčné charakteristiky cirkulujících nádorových buněk HCC.