Az új mikrofluidikus platformmal izolált májrák CTC-k prognosztikus értéke

Kínában a hepatocelluláris karcinóma (HCC) előfordulása a negyedik, a halálozási arány pedig a második. A betegek kevesebb mint 20%-a részesült gyógyító reszekciós kezelésben. A legtöbb más HCC-s beteg prognózisa nagyon rossz, csak kémiai embolizáció, ablációs kezelés vagy szisztémás kezelés történik, és a kezelés hatása korlátozott. Hatékony markerekre van szükség a korai diagnózishoz, a kezeléshez, a prognózis előrejelzéséhez és a kezelési válasz értékeléséhez HCC-ben. Jelenleg az alfa-fetoprotein (AFP) a HCC leggyakoribb markere, amely felhasználható a diagnózis és a betegek prognózisa szempontjából. Az AFP azonban kevésbé érzékeny a HCC diagnózisában. Bár néhány más marker, mint például az AFP heteromer, az abnormális protrombin is szerepet játszik a HCC diagnózisában, a klinikai gyakorlatban nem terjedtek el széles körben. A májbiopszia segít a daganat molekuláris biológiájának közvetlen értékelésében, de fennáll a vérzés és a tumor disszeminációjának kockázata, amelyet jelenleg ritkán használnak a HCC diagnosztizálására. Ezenkívül a tumor heterogenitása miatt a májpunkciós biopszia nem tükrözi megfelelően a tumor általános jellemzőit.

A folyékony biopszia a daganatok diagnosztizálásának, kimutatásának és kezelésének különböző aspektusaiban használható, beleértve a keringő tumorsejteket, a keringő tumor DNS-t, a keringő miRNS-t, a metabolitokat stb. Keringő daganatsejtek (keringő tumorsejtek, CTC-k) a tumorcsoportból a keringő rendszerbe a tumorsejtek áttételének kulcstényezője. A legtöbb CTC elpusztulhat anoikisis, immuntámadás vagy nyírási stressz következtében. A környezethez való alkalmazkodás érdekében a CTC-k számos változáson mennek keresztül, például az epiteliális-mezenchimális átmeneten (EMT). A daganatsejtek EMT-n mennek keresztül, és elveszítik az epiteliális sejtmarkereket, és stromasejteket sajátítanak el. Így a CTC-k a tumorszövet különböző régióiból származó sejtek csoportja, amelyek heterogének és kritikus szerepet játszanak a tumor progressziójában. A CTC-k nemcsak minimálisan invazívak, hanem tükrözhetik a tumorszövet heterogenitását is. A CTC-k a primer tumorszövet genomiális információit közvetítik, amelyek a CTC-k teljes genom szekvenálásán keresztül közvetetten tükrözhetik a génmutációról, a kópiaszám-variációról és a tumorszövetben jelentkező tumormutációs terhelésről szóló információkat, segítve ezzel a klinikusokat. a kezelési terv kidolgozásához. Például az előzetes tanulmányok kimutatták, hogy a CTC-k kópiaszám-változása nagy összhangban van az elsődleges HCC-szövetekkel.

A CTC-ket alaposan tanulmányozták több szolid tumorban. Például áttétes prosztatarákban szenvedő betegeknél a CTC-k száma pontosan megjósolhatja a betegek prognózisát és tükrözi a kezelést. A HER2-pozitív CTC-sejtek vizsgálata emlőrákos betegekben segít meghatározni a kijelölt beteg kezelési rendjét. Azonban a HCC sebészeti reszekcióban szenvedő betegeknél a CTC-k száma vaszkuláris invázióval, AFP-szinttel, tumorstádiummal, tumor progressziójával és a beteg rossz prognózisával volt összefüggésben. A közelmúltban kimutatták, hogy a posztoperatív adjuváns TACE képes meghosszabbítani a betegek túlélési idejét HCC-reszekció után preoperatív EpCAM-pozitív CTC-vel, anélkül, hogy szignifikáns hatással lenne a CTC-negatív betegekre. A CTC-k száma azonban minimális volt, és fennállt a heterogenitás. A CTC-k kimutatásának számos korlátozása van, és a CTC-k pontos kimutatása továbbra is zavaró probléma. A CTC-k izolálására jelenleg használt platform elsősorban tumorsejt-markereken, biofizikai tulajdonságokon vagy dúsítás nélküli stratégiákon alapul. A tumorfelszíni markereken alapuló izolálást specifikus antitestek segítségével válogattuk: a leukocitákat eltávolítottuk a leukocita felszíni markerekből (például CD45), azaz negatív válogatás; A CTC-ket elválasztottuk a tumorsejt felszíni markerektől (EpCAM, ASGPR, CK), i. azaz pozitív rendezés. Ennek a megközelítésnek az a korlátja, hogy a markerek kiválasztása nem tükrözi a tumor heterogenitását, és csökkenti a sejtaktivitást. A sejttérfogaton, a CTC-k rugalmasságán és vezetőképességén alapuló elválasztási módszerek, mint például a mikroszűrés, a gradiens centrifugálás és az inerciális fókusz, elkerülik a felületi markerek elválasztáshoz való használatának korlátait, miközben csekély hatással vannak a sejtaktivitásra. Dúsítási módszerek nélkül, nagy sebességű fluoreszcens képalkotással, közvetlenül meg lehet különböztetni a CTC-ket a betegek vérében.

A Shenzhen Jingyi Medical Laboratory által használt CTC-100 keringő tumorsejt-érzékelő rendszert a Shenzhen I. osztályú orvosi eszközök nyilvántartására (rekordszám: 20190047) benyújtották, és forgalomba került. A rendszer képes hatékonyan rögzíteni a dúsított CTC-t. A szűrés megvalósításához elsősorban a mikrofluidikus chip inerciális fókuszálási elvére és a rugalmas fizikai jellemzőkre támaszkodik. Ez az eszköz az egyenes csatornában laminárissá teszi a folyadékot, a folyadék a csatornafal közelében a legalacsonyabb, míg a maximális folyadéksebesség a csatorna közepén. Ez az áramlási sebesség-eloszlás nyíróerő gradienst hoz létre, és az ebből eredő emelés a részecskéket a falhoz nyomja. Amikor közel kerül a csatorna falához, a csatornafal által kiváltott emelés ismét eltolja a részecskéket a csatorna falától. Mindkét ellentétes irányú emelőerőt tehetetlenségi emelésnek nevezzük, ez az erő hat a részecskékre, egyensúlyi helyzetbe mozgatja. Így a részecskék a stabil helyre fókuszálnak, fókuszált áramlást alkotnak. A sejtrészecskék folyadékvándorlással vándorolnak a mikrofluidikus chip csatornákban, a CTC és a fehérvérsejtek eltérő mérete és rugalmassága miatt, végül különböző egyensúlyi helyzetekre fókuszálnak, így érik el a szűrési hatást. A szűrt tumorsejtek azonosítani tudják felszíni glikokémiai és biológiai jellemzőiket (EpCAM, PDL1, VEGF stb.), végül nagy érzékenységű és specifikus CTC szűrést és azonosítást érnek el. Preklinikai vizsgálataink azt mutatták, hogy az ezzel a technikával tesztelt CTC-k száma szignifikánsan magasabb volt májrákos betegekben, mint cirrhosisban és egészséges betegekben, és pozitív összefüggést mutatott a máj vaszkuláris inváziójával és a daganat méretével (102 májrák, 43 cirrhosis és 10 egészséges beteg). . Ennek a technikának a kimutatási aránya 100% volt HCC-s betegeknél, és a CTC-ben kimutatott sejtek 64,7%-a volt EpCAM-negatív. A teljes genom szekvenálása azt találta, hogy a CTC-ben lévő génmutációk összhangban vannak a megfelelő rákos szövettel (5 CTC-minta). és a megfelelő sebészeti reszekciós szövet), ami arra utal, hogy a CTC-k olyan információkat tükrözhetnek, mint a génmutációk a rákos szövetben.

A tanulmány célja a CTC-k izolálása májrákos betegek perifériás vénás vérében inerciális fókuszálási elven alapuló mikrofluidikus eszközzel, meghatározza a CTC-k száma és a beteg prognózisa és a kezelési válasz közötti összefüggést, mutációt, kópiaszám változást és mutációs terhelést CTC sejtekben. és a megfelelő szövetek egysejtű teljes genom szekvenálási technológiáját alkalmazva, és bioinformatikai elemzést alkalmaznak a CTC heterogenitására és a klinikai eredménnyel való kapcsolatára vonatkozóan. Ezenkívül a CTC-k in vitro tenyésztését organoid tenyésztéssel vagy gömbkultúrával vizsgáltuk, hogy CTC-sejtvonalakat nyerjünk a HCC metasztatikus mechanizmusainak feltárására. A projekt partnere a Cellomics International Limited, amely a Cellomics CTC-100 sejtválogatót és a kapcsolódó fogyóeszközöket tudna biztosítani ehhez a projekthez. Körülbelül 300 kezdeti májrákos beteg perifériás vénás vérét gyűjtik össze, és a CTC-sejteket minden beteg 8 ml-ében szétválogatják, és a fehérje expressziója szerint típusozzák. Összegyűjtjük a klinikai adatokat, a kezelés hatását és a betegek túlélési idejét, végül elemezzük a CTC-k száma és az alcsoport közötti összefüggést a kezelésre adott válaszokkal és a beteg prognózisával. A HCC CTC-k genomiális jellemzőinek feltárása új alapot teremt a HCC precíz kezeléséhez. A Hrák új diagnosztikai markereit miRNS expressziós spektrum chip és metabolomikus vizsgálattal találtuk meg. Előzetesen feltártuk a HCC-ben keringő tumorsejtek in vitro tenyésztési módszereit és celluláris jellemzőit.