Wartość prognostyczna CTC raka wątroby wyizolowanych przez nową platformę mikroprzepływową

W Chinach częstość występowania raka wątrobowokomórkowego (HCC) zajmuje czwarte miejsce, a śmiertelność jest druga. Mniej niż 20% pacjentów było w stanie otrzymać leczniczą terapię resekcyjną. Większość pozostałych pacjentów z HCC ma bardzo złe rokowanie, wystarczy embolizacja chemiczna, leczenie ablacyjne lub leczenie systemowe, a efekt leczenia jest ograniczony. Skuteczne markery są wymagane do wczesnej diagnozy, leczenia, prognozowania rokowania i oceny odpowiedzi na leczenie w HCC. Obecnie alfa-fetoproteina (AFP) jest najczęstszym markerem HCC, który może być wykorzystany do jego diagnostyki i rokowania. Jednak AFP ma mniejszą czułość w diagnostyce HCC. Chociaż niektóre inne markery, takie jak heteromer AFP, nieprawidłowa protrombina, również odgrywają rolę w rozpoznawaniu HCC, nie były one powszechnie stosowane w praktyce klinicznej. Biopsja wątroby pomaga bezpośrednio ocenić biologię molekularną guza, ale niesie ze sobą ryzyko krwawienia i rozsiewu guza, co obecnie jest rzadko stosowane w diagnostyce HCC. Ponadto biopsja nakłucia wątroby ze względu na niejednorodność guza może nie odzwierciedlać odpowiednio ogólnej charakterystyki guza.

Płynna biopsja może być stosowana w różnych aspektach diagnostyki, wykrywania i leczenia nowotworów, w tym krążących komórek nowotworowych, krążącego DNA guza, krążących miRNA, metabolitów itp. Krążące komórki nowotworowe (krążące komórki nowotworowe, CTC) z grupy guza do układu krążenia komórek nowotworowych, jest kluczowym czynnikiem powstawania przerzutów nowotworowych. Większość CTC może umrzeć z powodu anoikizy, ataku immunologicznego lub stresu ścinającego. Aby przystosować się do środowiska, CTC przechodzą szereg zmian, takich jak przejście nabłonkowo-mezenchymalne (EMT). Komórki nowotworowe przechodzą EMT i tracą markery komórek nabłonkowych i nabywają cechy komórek zrębowych. Zatem CTC to grupa komórek pochodzących z różnych regionów tkanki nowotworowej, które są heterogenne i odgrywają kluczową rolę w progresji nowotworu. CTC są nie tylko minimalnie inwazyjne, ale mogą również odzwierciedlać niejednorodność tkanki nowotworowej. CTC przekazują informacje genomowe z pierwotnej tkanki nowotworowej, które mogą pośrednio odzwierciedlać informacje o mutacji genu, zmienności liczby kopii i ładunku mutacji guza w tkance nowotworowej poprzez sekwencjonowanie całego genomu CTC, pomagając klinicystom opracować plan leczenia. Na przykład wstępne badania wykazały, że zmienność liczby kopii w CTC ma wysoką zgodność z pierwotnymi tkankami HCC.

CTC były szeroko badane w wielu guzach litych. Na przykład u pacjentów z przerzutowym rakiem prostaty liczba CTC może dokładnie przewidzieć rokowanie pacjentów i odzwierciedlać leczenie. Badanie komórek CTC HER2-dodatnich u pacjentek z rakiem piersi pomaga określić schemat leczenia wyznaczonej pacjentki. Jednak u pacjentów po chirurgicznej resekcji HCC liczba CTC była związana z inwazją naczyniową, poziomem AFP, stopniem zaawansowania guza, progresją guza i złym rokowaniem pacjenta. Ostatnio wykazano, że pooperacyjna adjuwantowa TACE jest w stanie wydłużyć czas przeżycia chorych po resekcji HCC z przedoperacyjnym EpCAM-dodatnim CTC, bez istotnego wpływu u chorych z CTC-ujemnym. Jednak liczba CTC była minimalna, a heterogeniczność istniała. Istnieje wiele ograniczeń dotyczących wykrywania CTC, a sposób dokładnego wykrywania CTC jest nadal problemem, który nas niepokoi. Stosowana obecnie platforma do izolowania CTC opiera się przede wszystkim na markerach komórek nowotworowych, właściwościach biofizycznych lub strategiach bez wzbogacania. Izolację opartą na markerach powierzchniowych guza sortowano przy użyciu swoistych przeciwciał: leukocyty usunięto z markerów powierzchniowych leukocytów (takich jak CD45), czyli sortowanie negatywne; CTC oddzielono od markerów powierzchniowych komórek nowotworowych (EpCAM, ASGPR, CK), tj. e. pozytywne sortowanie. Ograniczeniem tego podejścia jest fakt, że selekcja markerów nie odzwierciedla heterogeniczności guza i zmniejsza aktywność komórkową. Metody separacji oparte na objętości, elastyczności i przewodnictwie komórek CTC, takie jak mikrofiltracja, wirowanie w gradiencie i ogniskowanie bezwładnościowe, pozwalają uniknąć ograniczeń związanych z użyciem markerów powierzchniowych do separacji, mając jednocześnie niewielki wpływ na aktywność komórek. Bez metod wzbogacania, przy użyciu szybkiego obrazowania fluorescencyjnego, można rozróżnić CTC bezpośrednio we krwi pacjentów.

System wykrywania krążących komórek nowotworowych CTC-100 używany przez Laboratorium Medyczne Shenzhen Jingyi został zgłoszony do rejestru wyrobów medycznych klasy I w Shenzhen (nr wpisu: 20190047) i znajduje się na rynku. System jest w stanie skutecznie wychwycić wzbogacony CTC. Opiera się głównie na zasadzie bezwładnościowego ogniskowania chipa mikroprzepływowego i elastycznych właściwościach fizycznych w celu realizacji przesiewania. Urządzenie to sprawia, że ​​płyn jest laminarny w kanale prostym, płyn przy ściance kanału jest najniższy, natomiast maksymalna prędkość płynu w środku kanału. Ten rozkład prędkości przepływu wytwarza gradient siły ścinającej i indukuje wynikową siłę nośną, która popchnie cząstki do ściany. Kiedy zbliża się do ściany kanału, siła nośna wywołana przez ścianę kanału ponownie odpycha cząstki od ściany kanału. Obie siły nośne w przeciwnych kierunkach nazywane są windą bezwładnościową, ta siła działa na cząstki, przesuwa je do położenia równowagi. W ten sposób cząstki skupiają się na stabilnym miejscu, tworząc skupiony przepływ. Cząsteczki komórek migrują wraz z migracją cieczy w kanałach chipów mikroprzepływowych, ze względu na różną wielkość i elastyczność CTC i białych krwinek, ostatecznie skupiając się na różnych pozycjach równowagi, osiągając w ten sposób efekt przesiewania. Przeszukiwane komórki nowotworowe mogą identyfikować ich właściwości glikochemiczne powierzchni i właściwości biologiczne (EpCAM, PDL1, VEGF, itp.), a na koniec osiągają wysoką czułość i swoiste badanie przesiewowe i identyfikację CTC. Nasze badania przedkliniczne wykazały, że liczba CTC testowanych tą techniką była znacznie wyższa u pacjentów z rakiem wątroby niż u pacjentów z marskością wątroby i u zdrowych pacjentów oraz była dodatnio związana z inwazją naczyń wątroby i wielkością guza (102 pacjentów z rakiem wątroby, 43 z marskością wątroby i 10 zdrowych pacjentów). . Wskaźnik wykrywalności tej techniki wyniósł 100% u pacjentów z HCC, a 64,7% komórek wykrytych w CTC było ujemnych pod względem EpCAM. Sekwencjonowanie całego genomu wykazało, że mutacje genów w CTC były zgodne z odpowiednią tkanką nowotworową (5 próbek CTC i odpowiednią tkankę resekcji chirurgicznej), co sugeruje, że CTC mogą odzwierciedlać informacje, takie jak mutacje genów w tkance nowotworowej.

Niniejsze badanie ma na celu wyizolowanie CTC w obwodowej krwi żylnej pacjentów z rakiem wątroby za pomocą urządzenia mikroprzepływowego opartego na zasadzie ogniskowania bezwładnościowego, określenie związku między liczbą CTC a rokowaniem pacjenta i odpowiedzią na leczenie, wykrycie mutacji, zmienności liczby kopii i ładunku mutacji w komórkach CTC i odpowiadających im tkanek przy użyciu technologii sekwencjonowania całego genomu pojedynczej komórki i wykorzystania analizy bioinformatycznej heterogeniczności CTC i jej związku z wynikami klinicznymi. Ponadto zbadano hodowlę CTC in vitro przez hodowlę organoidów lub hodowlę sferyczną w celu uzyskania linii komórkowych CTC w celu ujawnienia mechanizmów przerzutowych HCC. Partnerem tego projektu jest firma Cellomics International Limited, która może dostarczyć sortownik komórek Cellomics CTC-100 i powiązane materiały eksploatacyjne do tego projektu. Zostanie pobrana krew z żył obwodowych od około 300 pacjentów z pierwotnym rakiem wątroby, a komórki CTC zostaną posortowane w 8 ml każdego pacjenta i wpisane zgodnie z ekspresją białka. Zostaną zebrane dane kliniczne, efekt leczenia i czas przeżycia pacjentów, a na koniec przeanalizowana zostanie zależność między liczbą CTC i podgrupą z odpowiedzią na leczenie a rokowaniem pacjentów. Odkrycie właściwości genomowych CTC HCC zapewnia nową podstawę do precyzyjnego leczenia HCC. Nowe markery diagnostyczne dla Hcancer odkryto za pomocą chipa widma ekspresji miRNA i testów metabolomicznych. Wstępnie zbadano metody hodowli in vitro i charakterystykę komórkową krążących komórek nowotworowych HCC.