Řešení asymptomatických plazmodiových rezervoárů k urychlení eliminace a vymýcení malárie ve Rwandě.

Podle zprávy Světové zdravotnické organizace (WHO) o světové malárii 2021 bylo v roce 2020 zaznamenáno 241 milionů případů malárie, přičemž ve stejném roce podle odhadů zemřelo 627 000 – což je nárůst o 69 000 úmrtí oproti předchozímu roku. Africký kontinent nadále nese neúměrně vysoký podíl celosvětové zátěže malárie. V roce 2020 byl region domovem 95 % všech případů malárie a 96 % úmrtí. Děti do 5 let představovaly asi 80 % všech úmrtí na malárii v kraji. Navzdory obdivuhodnému pokroku v prvních 15 letech tohoto století došlo k neúspěchům, pokud jde o dosažení odstranění malárie.

Malárie je parazitická infekce přenášená vektory způsobená druhy Plasmodium. Čtyři hlavní lidské druhy jsou: P. falciparum, nejvirulentnější a převládající druh v subsaharské Africe, P. Ovale, P. vivax a P. malariae a jeden zoonotický druh P. knowlesi. Jde o onemocnění zodpovědné za katastrofální zdravotní a socioekonomické dopady především kvůli Plasmodium falciparum, které je odpovědné za značnou morbiditu a mortalitu zejména u dětí do pěti let a těhotných žen.

Když komár Anopheles přenášející Plasmodium přijme jedinci krevní moučku, sliny jsou injikovány spolu se sporozoity, které migrují do jater, čímž zahájí cyklus. Jakmile se člověk nakazí, jaterní cyklus trvá 10 až 14 dní (v případě P. falciparum), po kterých jsou tisíce nepohlavně se rozmnožujících merozoitů uvolňovány do periferní krve, kde napadají a vyvíjejí se uvnitř zralých erytrocytů. Paraziti v krevním stádiu jsou ti, kteří způsobují příznaky malárie. Nepřetržitě během asexuální replikace v krevním řečišti prochází malá část parazitů pohlavním vývojem, který v případě P. falciparum trvá přibližně 10 dní, což vede k produkci přenosných gametocytových forem. Tyto gametocyty zodpovědné za přenos parazitů z lidí na komáří přenašeče jsou necitlivé na většinu konvenčních antimalarických léků a často mají dlouhou životnost (životnost populace až 55 dní po úspěšné antimalarické terapii), čímž zajišťují přenos malárie během několika týdnů. Přerušení přenosu malárie proto vyžaduje vývoj nových antigametocytárních léků s bezpečnostními profily, které umožňují léčebné kampaně pro celou populaci.

Rwanda udělala v posledních dvou desetiletích velké pokroky, když strategicky investovala do posílení zdravotního systému, zlepšila přístup k péči zřízením komunitního zdravotního pojištění, což vedlo k podstatnému snížení zátěže nemocemi. Od roku 2012 však země zažívá trvalý vzestup malárie. Od roku 2012 do roku 2018 se výskyt malárie výrazně zvýšil ze 48 na 1000 na 403 na 1000, což je téměř 10x nárůst. Do roku 2019-2020 se počet případů snížil o více než polovinu, na 198 na 1000. Přestože přenos je ve Rwandě heterogenní, celá populace je považována za ohroženou malárií. Primárním druhem Plasmodium (P.) nalezeným ve Rwandě, původcem tohoto onemocnění, je P. falciparum, ale byly také identifikovány P. malariae a P. ovale, a to většinou v kosmopolitním hlavním městě Kigali, kam se často dostává. cestovatelů a turistů.

Navzdory dosaženým výdobytkům si nedávný vzestup a obavy z rostoucí rezistence vůči lékům vyžadují dynamičtější, dostupnější, nákladově efektivnější a adaptabilnější mechanismy pro boj s malárií a potenciální její eliminaci. Během poslední dekády bylo zavedeno několik opatření v oblasti veřejného zdraví, která se pokoušela vymýtit malárii, ale tento cíl je dodnes v nedohlednu a země, stejně jako většina subsaharské Afriky, i Rwanda nadále čelí vysokému břemenu úmrtnosti a nemocnosti na malárii.

Ve Rwandě a mnoha dalších afrických domácnostech mají rodiny často mladší děti i starší prarodiče, kteří žijí společně. Když má člen domácnosti rezervoáry Plasmodium, vystavuje to jak mladší děti, tak starší zranitelnější členy rodiny riziku opakujících se závažných infekcí malárie. Význam asymptomatických domácích nosičů pro udržení přenosu malárie byl prokázán jak v jihovýchodní Asii, tak v Africe.

Opatření pro kontrolu malárie, která jsou v současné době nasazena, zahrnují selektivní použití různých strategií doporučených WHO, jako je kontrola rozmnožování komárů, včasná diagnostika a řízení případů, stejně jako použití chemoprofylaxe u vysoce zranitelných skupin populace, jako jsou děti do 5 let, těhotné ženy a další. návštěvníků z neendemických zón. To přineslo v posledních letech určité přínosy v celosvětovém snižování zátěže malárie a generuje zvýšené naděje na eliminaci/eradikaci malárie v blízké budoucnosti. Tyto zisky jsou však vážně ohroženy vznikem a celosvětovým rozšířením rezistence na insekticidy a antimalarika. Rezistence na kombinovanou terapii artemisininem (ACT), léčbu první linie doporučenou WHO, je evidentní v jihovýchodní Asii a byla hlášena také v afrických zemích. Odstranění malárie si proto vyžádá vývoj inovativních přístupů a nástrojů, včetně nových možností léčby a opatření pro kontrolu vektorů.

Během roku 2021 WHO doporučila použití vakcíny proti malárii RTS, S/S2 pro prevenci malárie P. falciparum u dětí žijících v oblastech se středním až vysokým přenosem, jak je definováno WHO. Nicméně studie fáze 3 prokázaly relativně malou účinnost a skutečnost, že samotná vakcína pravděpodobně sama o sobě nesplní cíl eradikace malárie. Vzhledem k tomu, že se připravují další kandidáti na vakcíny, které jsou hodnoceny ve zkouškách vakcín, existuje naděje, že se budou i nadále vyvíjet alternativní cíle pro parazity a vakcinační strategie. Dalším pozitivem z poslední doby je kombinovaná RTS, S/S2 vakcína a chemoprevence, která ukázala, že tento přístup nebyl horší než samotná chemoprevence v prevenci nekomplikované malárie. Kombinace těchto intervencí vedla k nižšímu výskytu nekomplikované malárie, těžké malárie a úmrtí na malárii než každá intervence samostatně.

V poslední době nová vakcína R21 prochází fází 2 zkoušek. Přestože je podobný RTS, S2, fúzuje dohromady antigen hepatitidy B a polovinu cirkumsporozoitového proteinu - větší část než v RTS, S2. Vývojáři věřili, že tato kombinace bude minimálně stejně účinná jako RTS, S, ale levnější. Ve dvojitě zaslepené, randomizované, kontrolované studii fáze 2b byla dětem ve věku 5–17 měsíců v Nanoro, Burkina Faso podána nízká dávka vakcíny R21 na bázi cirkumsporozoitového proteinu se dvěma různými dávkami adjuvans Matrix-M (MM ). R21/MM se v této kohortě afrických dětí jeví jako bezpečný a významně imunogenní a vykazuje slibnou účinnost.

Bylo provedeno více studií vakcíny s ozářením oslabenou vakcínou Plasmodium falciparum sporozoite (PfSPZ), o které se předpokládá, že poskytuje ochranu proti infekci P. falciparum u dospělých a dětí dosud neléčených malárií. Preklinické studie ukazují, že k ochraně je nutná imunita zprostředkovaná T buňkami a po vakcinaci se u lidí snadno vyvolává. Nebyla však žádná významná ochrana proti infekci P. falciparum v žádné dávkové skupině po 6 měsících, což byl primární cíl studie.

Asymptomatická malárie převládá v endemických oblastech a ve všech ročních obdobích a jejich identifikace často vyžaduje použití vysoce citlivých diagnostických nástrojů, včetně molekulárních přístupů, jako je PCR. Eliminace malárie v oblastech se stabilním přenosem malárie bude proto vyžadovat udržitelné používání integrovaných přístupů vektor-parazit zaměřených jak na lidské asymptomatické rezervoáry, tak na rezervoáry vektorů, přičemž je třeba věnovat pozornost toxicitě léků a zajistit, aby se rezistence dále nezhoršovala.

Literatura ukazuje, že asymptomatické rezervoáry lze v programech hromadné léčby eliminovat. V minulosti byly navrženy různé masové léčebné strategie (Mass drug administration (MDA)), které se pokusily rychle snížit malárii zejména v oblastech se sezónním přenosem malárie v částech Afriky a v Číně. Bohužel použití ACT v komunitně zaměřené léčbě asymptomatické malárie představuje výzvu nejen z hlediska lékové rezistence, ale také pozorování potenciace proliferace gametocytů po podání ACT. Na rozdíl od výše uvedených problémů s ACT, které mají být použity v MDA, studie in vitro prokázaly, že infuze nebo práškové listy Artemisia annua a Artemisia afra byly účinné, přičemž obě jasně prokázaly silnou inhibici parazitémie a gametocytémie. Bylo také prokázáno, že Artemisia annua obsahuje nejen artemisinin, ale také další složky, které vykazují synergický komplexní účinek proti malárii. Artemisia afra neobsahuje žádný artemisinin. V nedávné dvojitě zaslepené klinické studii na lidech a v jiných předchozích studiích bylo hlášeno, že obě rostliny stabilně léčí malárii, včetně případů rezistence na ACT, stejně jako zabíjejí přenosné formy gametocytů. Jejich chemoprotektivní potenciál byl také pozorován v těchto a dalších studiích.

Věříme, že pro účinné dosažení eliminace malárie ve Rwandě je zásadní zaměřit se na lidský rezervoár P. falciparum pomocí místních a snadno dostupných infuzí Artemisia. Asymptomatické infekce detekovatelné pomocí PCR jsou důležitým rezervoárem, protože často přetrvávají měsíce a obsahují gametocyty, stádium parazita infekčního pro komáry.

III. Cíle výzkumu Obecný cíl; Poskytnout důkaz konceptu, že infuze Artemisia, jak annua, tak afra, jsou účinné a dostatečné k odstranění zbytkových rezervoárů Plasmodium po léčbě malárie. Vyšetřovatelé určí současnou prevalenci lidských rezervoárů Plasmodium v ​​naší komunitě au našich pacientů po malárii, a to jak divokého typu, tak mutovaných/rezistentních kmenů v nemocnici King Faisal Hospital a přidružených zdravotnických zařízeních. Dále určíme ty, které souvisí s mutací v genu Kelch13 nebo jiných kandidátních genech zapojených do selhání léčby.

Specifické cíle;

1. Poskytněte důkaz koncepce, že infuze Artemisia jsou účinné a dostatečné k vyprázdnění lidských zásobníků Plasmodium u asymptomatických dobrovolníků v komunitě a po léčbě malárie.
2. Prozkoumejte shluky domácností P. falciparum u starých pacientů s malárií do pěti let a také u jedinců infikovaných kmeny nesoucími mutace spojené s odolností vůči léčbě a prozkoumejte, jak lze sestrojení registru rodin malárie použít jako nástroj pro lepší kontrolu nemocí ve Rwandě
3. Posoudit bezpečnost Artemisia afra a Artemisia annua sledováním chemických testů moči, ledvin (močovina, kreatinin a elektrolyty) a jaterních testů (transaminázy, bilirubin).
4. Prozkoumat profylaktický potenciál infuzí Artemisia, jakmile se rezervoáry vyčistí.
5. Posoudit využití a přijatelnost bylinné medicíny Artemisia ve rwandských komunitách.
6. Studujte socioekonomický dopad odvodňování lidských nádrží Plasmodium ve rwandské komunitě.

IV. Metodologie

Prostředí studie Studie bude provedena na pacientech, kteří vyhledávají lékařskou péči kvůli malárii v nemocnici King Faisal Hospital, přidružených zdravotnických zařízeních, CHUB, a také v komunitě zaměřené na asymptomatické přenašeče Plasmodium.

Návrh studie Studie bude provedena jako důkaz konceptu otevřené randomizované kontrolované studie s použitím permutované blokové randomizace/náhodně různých velikostí. Vyšetřovatelé naberou nejméně 125 účastníků do 14 dnů po dokončení standardní léčby malárie. Pacienti budou požádáni, aby podepsali informovaný souhlas, a bude provedena PCR/RT-PCR k testování rezervoárů P. falciparum. Použijeme prahovou hodnotu cut-off cyklu (hodnota CT) Real Time PCR (qPCR) vyšší nebo rovnou 40, která byla stanovena na základě negativní africké kontroly a evropských kontrol, které nikdy předtím nebyly vystaveny malárii. Vzorky krve od rekrutovaných účastníků budou také zkoumány na jednonukleotidové polymorfismy (SNP) v genu Kelch13 sekvenováním domény vrtule tohoto genu, v níž byly hlášeny bodové mutace spojené s rezistencí na artemisinin. V případě nepřítomnosti SNP v K13 bude hledání další genové mutace spojené se selháním léčby provedeno sekvenováním celého genomu a dále bude řešeno laboratorními testy na kultivaci parazitů. Z prověřovaných účastníků bude poté sto (100) s reziduálními parazity (indukovanými rezervoáry) rozděleno do 3 skupin: dvě intervenční skupiny a 1 kontrolní skupina

Stanovení velikosti vzorku Vyšetřovatelé plánují studii nezávislých případů a kontrol s 1 kontrolou pro 2 případy. Předběžná data naznačují, že míra selhání mezi kontrolami je ≥ 0,75. Pokud je skutečná míra selhání u léčených subjektů ≤ 0,25, potřebujeme studovat alespoň 40 léčených subjektů a 20 kontrol, abychom detekovali takový rozdíl s 95% silou na hladině významnosti 0,05. Budeme tak vyžadovat 40 pacientů v každé intervenční skupině a 20 kontrol, celkem 100. Abychom mohli randomizovat 100, plánujeme během našeho stanoveného období náboru provést screening alespoň 125 pacientů. Na základě skutečnosti, že děti do 5 let jsou nejzranitelnější s nejvyšší úmrtností a nemocností na malárii a nebudou se účastnit našich klinických studií, zařadíme je jako indexové případy pro náš průzkum skupin domácností. Členové domácností těchto dětí tak budou vyšetřeni pomocí PCR, aby se zjistil stav rezervoárů plasmodia a aby se zjistilo, zda v plasmodiu cirkulujícím v domácnosti nejsou nějaké významné mutace. Potvrzené rezervoáry u dospělých členů domácnosti, kteří souhlasí, budou ošetřeni čajem Artemisia.

Studijní populace Pro klinický přístup bude studie získávat dospělé ve věku od 18 do 65 let pro intervenci čaje Artemisia proof of concept v období od 15. dubna 2023 do 30. června 2026. Avšak na základě skutečnosti, že děti do 5 let jsou nejzranitelnější s nejvyšší úmrtností, budou děti do 5 let po léčbě malárií zahrnuty jako indexové případy pro náš průzkum skupin domácností a vývoj rodinného registru. Ačkoli děti nebudou zahrnuty do tohoto počátečního důkazu koncepční studie, máme v úmyslu vyvinout galenické formulace vhodné pro pediatrickou věkovou skupinu v pozdější fázi.

Pro komunitní přístup budou asymptomatičtí členové domácnosti vyšetřeni pomocí PCR/RT-PCR, aby se stanovil stav rezervoárů Plasmodium a aby se zjistilo, zda existují nějaké mutace ve zbytkovém Plasmodiu cirkulujícím v domácnosti. Na základě toho bude vytvořen rodinný registr kolem případů indexu malých dětí jako nástroj pro sledování a čaj Artemisia bude podáván dospělým s cílem odstranit klastrové nádrže v domácnostech. Poté budeme alespoň po dobu 6 měsíců sledovat, zda jsou nějaké rozdíly mezi dětmi, jejichž shluky v domácnosti byly léčeny infuzemi, a těmi, které nebyly, pokud jde o infekce malárie. To bude testováno jako další potenciální opatření pro sledování a kontrolu malárie.

Abychom dále prozkoumali, zda by infuze Artemisia mohly mít profylaktický potenciál, máme v úmyslu pokračovat ve studii s již přihlášenými účastníky změnou dávkování. 75 % účastníků s vyprázdněným zásobníkem bude náhodně rozděleno do 3 skupin: první skupina 12 účastníků bude pokračovat s čajem Artemisia jeden šálek (335 ml) 10 g/l (A. afra) nebo 10 g/l (A. annua) každý den; druhá skupina 12 účastníků obdrží čaj Artemisia jeden šálek (335 ml) 10g/l (A. afra) nebo 10 g/l (A. ročně) jednou týdně; poslední skupinou 6 účastníků budou kontroly. Pokud se infuze Artemisia s blokem A. afra nebo A. annua rezervoár Plasmodium naplní u více než 75 % účastníků ve srovnání s méně než 25 % kontrol, pak bude mít studie 95% schopnost detekovat rozdíl mezi profylaktická skupina a kontroly na hladině významnosti 0,025.

Pro sledování toxicity budou na začátku a po 14 dnech čaje Artemisia vyšetřeny funkční testy ledvin a jater a také jednou měsíčně během profylaktické fáze po dobu nejméně 6 měsíců.

Pro řešení přijatelnosti a dopadu výzkumných intervencí budou provedeny příslušné průzkumy.

Správa a analýza dat Se všemi daty bude nakládáno podle standardních zásad důvěrnosti a budou spravována pomocí EpiInfo a analyzována pomocí softwarových balíčků STATA 17. Účastníci budou popsáni na základě jejich sociodemografických charakteristik jako průměrů a směrodatných odchylek u spojitých proměnných nebo podílů u kategoriálních proměnných. K určení pravděpodobnosti vyprázdnění plazmodiového rezervoáru bude použita analýza záměrného ošetření (ITT) s použitím dvou podílů vzorků. Bude provedena analýza přežití s ​​Coxovou regresí, aby se vyhodnotila doba vyprazdňování plasmodiového rezervoáru a doba rerudescence / reinfekce. Data budou porovnána mezi skupinami pomocí buď Chí-kvadrát nebo Fischer exaktního testu po kontrole nejmenší očekávané hodnoty. Průměrná změna od výchozí hodnoty Průměry budou porovnány buď pomocí parametrického (studentské t nebo ANOVA) nebo neparametrického (Mann-Whitney/Wilcoxon nebo Kruskal-Wallis) testu po kontrole normality distribuce a rovnosti rozptylů.

Etická hlediska Všichni účastníci studie budou mít podrobné vysvětlení studie a budou požádáni, aby svobodně podepsali písemný informovaný souhlas. Etická prověrka byla schválena Rwandským národním etickým výborem (120/RNEC/2022 květen 2022, pozměněno říjen 2022). Žádost o povolení úřadu pro potraviny a léčiva ve Rwandě byla zahájena.