Lidando com reservatórios assintomáticos de plasmódio para acelerar a eliminação e erradicação da malária em Ruanda.

De acordo com o relatório mundial de malária 2021 da Organização Mundial da Saúde (OMS), houve 241 milhões de casos de malária em 2020, com 627.000 mortes estimadas durante o mesmo ano - um aumento de 69.000 mortes em relação ao ano anterior. O continente africano continua a carregar uma parcela desproporcionalmente alta da carga global da malária. Em 2020, a Região abrigava 95% de todos os casos de malária e 96% das mortes. As crianças com menos de 5 anos de idade representaram cerca de 80% de todas as mortes por malária na Região. Apesar do progresso admirável nos primeiros 15 anos deste século, houve retrocessos no que diz respeito à eliminação da malária.

A malária é uma infecção parasitária transmitida por vetores causada por espécies de Plasmodium. Quatro principais espécies humanas são: P. falciparum, a espécie mais virulenta e predominante na África Subsaariana, P. Ovale, P. vivax e P. malariae, e uma espécie zoonótica P. knowlesi. É uma doença responsável por catastróficos impactos socioeconômicos e de saúde principalmente devido ao Plasmodium falciparum, que é responsável por substancial morbidade e mortalidade principalmente em crianças menores de cinco anos e mulheres grávidas.

Quando um mosquito Anopheles portador de Plasmodium se alimenta de sangue em um indivíduo, a saliva é injetada junto com os esporozoítos, que migram para o fígado, iniciando assim um ciclo. Uma vez infectados os seres humanos, o ciclo hepático dura de 10 a 14 dias (no caso do P. falciparum), após os quais milhares de merozoítos de reprodução assexuada são liberados no sangue periférico, onde invadem e se desenvolvem dentro dos eritrócitos maduros. Os parasitas da fase sanguínea são aqueles que causam os sintomas da malária. Em um padrão contínuo, durante a replicação assexuada na corrente sanguínea, uma pequena proporção dos parasitos sofre desenvolvimento sexual que dura aproximadamente 10 dias no caso do P. falciparum, resultando na produção de formas de gametócito transmissíveis. Esses gametócitos, responsáveis ​​pela transmissão do parasita de humanos para o mosquito vetor, são insensíveis à maioria dos medicamentos antimaláricos convencionais e geralmente têm vida longa (vida útil da população de até 55 dias após terapia antimalárica bem-sucedida), garantindo assim a transmissão da malária por várias semanas. Interromper a transmissão da malária requer, portanto, o desenvolvimento de novos medicamentos anti-gametócito com perfis de segurança que permitam campanhas de tratamento em toda a população.

Ruanda fez grandes progressos nas últimas duas décadas, investindo estrategicamente no fortalecimento do sistema de saúde, aumentando o acesso aos cuidados com o estabelecimento de seguro de saúde baseado na comunidade, resultando em reduções substanciais na carga de doenças. No entanto, desde 2012, o país tem experimentado um surto persistente de malária. De 2012 a 2018, a incidência da malária aumentou significativamente de 48 por 1.000 para 403 por 1.000, um aumento de quase 10 vezes. Em 2019-2020, o número de casos foi reduzido em mais da metade, para 198 por 1.000. Embora a transmissão seja heterogênea em Ruanda, toda a população é considerada em risco de malária. A principal espécie de Plasmodium (P.) encontrada em Ruanda, o agente responsável por esta doença, é o P. falciparum, mas P. malariae e P. ovale também foram identificados e isso ocorre principalmente na cidade cosmopolita de Kigali, que recebe frequentes viajantes e turistas.

Apesar dos ganhos obtidos, os recentes surtos e preocupações sobre a crescente resistência aos medicamentos exigem mecanismos mais dinâmicos, acessíveis, econômicos e adaptáveis ​​para combater e potencialmente eliminar a malária todos juntos. Na última década, foram instituídas várias medidas de saúde pública na tentativa de erradicar a malária, mas esse objetivo permanece indefinido até o momento e o país, e como a maior parte da África subsaariana, Ruanda continua a enfrentar uma alta carga de mortalidade e morbidade por malária.

Em Ruanda e em muitos outros ambientes domésticos africanos, as famílias frequentemente têm filhos mais novos e avós idosos morando juntos. Quando um membro da família tem reservatórios de Plasmodium, isso coloca tanto as crianças mais novas quanto os membros mais velhos e vulneráveis ​​da família em risco de infecções graves recorrentes por malária. A importância dos portadores domésticos assintomáticos na manutenção da transmissão da malária foi evidenciada tanto no Sudeste Asiático quanto na África.

As medidas de controle da malária atualmente implantadas incluem o uso seletivo de várias estratégias recomendadas pela OMS, como controle da proliferação de mosquitos, diagnóstico oportuno e gerenciamento de casos, bem como o uso de quimioprofilaxia para grupos populacionais altamente vulneráveis, como crianças menores de 5 anos, mulheres grávidas e visitantes de zonas não endêmicas. Isso proporcionou alguns ganhos na redução da carga da malária globalmente nos últimos anos e gerou maiores esperanças para a eliminação/erradicação da malária no futuro próximo. No entanto, esses ganhos estão seriamente ameaçados pelo surgimento e disseminação mundial da resistência a inseticidas e antimaláricos. A resistência à terapia combinada de artemisinina (ACTs), o tratamento de primeira linha recomendado pela OMS, é evidente no sudeste da Ásia e também foi relatada em países africanos. A eliminação da malária exigirá, portanto, o desenvolvimento de abordagens e ferramentas inovadoras, incluindo novas opções de tratamento e medidas de controle de vetores.

Durante 2021, a OMS recomendou o uso da vacina contra a malária RTS, S/S2 para a prevenção da malária P. falciparum em crianças que vivem em regiões com transmissão moderada a alta, conforme definido pela OMS. No entanto, os ensaios de fase 3 mostraram relativamente pouca eficácia e o fato de que a vacina em si provavelmente não atingirá a meta de erradicação da malária por si só. Com mais vacinas candidatas em andamento que estão sendo avaliadas em testes de vacinas, há esperança de que alvos alternativos de parasitas e estratégias de vacinação continuem a ser desenvolvidos. Outro resultado positivo recente é a combinação de RTS, vacina S/S2 e quimioprevenção, que mostrou que esta abordagem não era inferior à quimioprevenção sozinha na prevenção da malária não complicada. A combinação dessas intervenções resultou em menor incidência de malária não complicada, malária grave e morte por malária do que cada intervenção isoladamente.

Mais recentemente, uma nova vacina R21 passou por testes de fase 2. Apesar de ser semelhante ao RTS, S2, ele funde um antígeno da hepatite B e metade da proteína circunsporozoíta - uma porção maior que no RTS, S2. Os desenvolvedores acreditavam que essa combinação seria pelo menos tão eficaz quanto RTS, S, mas menos cara. Em um estudo duplo-cego, randomizado, controlado, de fase 2b, uma vacina R21 baseada em proteína circunsporozoíta de baixa dose foi administrada a crianças de 5 a 17 meses de idade em Nanoro, Burkina Faso, com duas doses diferentes de adjuvante Matrix-M (MM ). R21/MM parece seguro e significativamente imunogênico nesta coorte de crianças africanas e mostra eficácia promissora.

Mais testes de vacinas foram conduzidos com vacina de esporozoíto de Plasmodium falciparum atenuado por radiação (PfSPZ), com a hipótese de fornecer proteção contra infecção por P. falciparum em adultos e crianças virgens de malária. Estudos pré-clínicos mostram que a imunidade mediada por células T é necessária para proteção e é prontamente induzida em humanos após a vacinação. Não houve, no entanto, nenhuma proteção significativa contra a infecção por P. falciparum em qualquer grupo de dose em 6 meses, que foi o ponto final primário do estudo.

A malária assintomática é prevalente em regiões endêmicas e em todas as estações do ano, e sua identificação geralmente requer o uso de ferramentas de diagnóstico altamente sensíveis, incluindo abordagens moleculares como a PCR. A eliminação da malária em áreas com transmissão estável da malária exigirá, portanto, o uso sustentável de abordagens integradas de vetor-parasita visando tanto os reservatórios humanos assintomáticos quanto os reservatórios de vetores, prestando atenção à toxicidade dos medicamentos e garantindo que a resistência não piore ainda mais.

A literatura mostra que os reservatórios assintomáticos podem ser eliminados em programas de tratamento em massa. No passado, diversas estratégias de tratamento em massa (administração em massa de medicamentos (MDA)) foram propostas e testadas para reduzir rapidamente a malária, especialmente em regiões com transmissão sazonal da malária em partes da África e na China. Infelizmente, o uso de ACTs no tratamento comunitário da malária assintomática representa um desafio, não apenas pela resistência aos medicamentos, mas também pela observação da potencialização da proliferação de gametócitos após a administração de ACT. Ao contrário dos desafios relatados acima de ACTs para serem usados ​​em MDA, estudos in vitro demonstraram que as infusões de Artemisia annua e Artemisia afra ou as folhas em pó foram eficazes, onde ambos demonstraram claramente uma inibição potente da parasitemia e gametócitos. Também foi demonstrado que Artemisia annua contém não apenas artemisinina, mas também outros componentes que demonstram um complexo sinérgico de efeito antimalárico. Artemisia afra não contém artemisinina. Em um recente ensaio clínico humano duplo-cego e em outros estudos anteriores, foi relatado que ambas as plantas curam a malária de forma estável, incluindo casos resistentes a ACT, bem como matam formas de gametócitos transmissíveis. Seu potencial quimioprotetor também foi observado nesses e em outros estudos.

Acreditamos que, para alcançar efetivamente a eliminação da malária em Ruanda, é fundamental atingir o reservatório humano de P. falciparum usando infusões locais e prontamente disponíveis de Artemisia. Infecções assintomáticas detectáveis ​​por PCR são um reservatório importante, porque muitas vezes persistem por meses e abrigam gametócitos, o estágio do parasita que infecta os mosquitos.

III. Objetivos da pesquisa Objetivo geral; Fornecer uma prova de conceito de que as infusões de Artemisia, tanto annua quanto afra, são eficientes e suficientes para eliminar os reservatórios residuais de Plasmodium após o tratamento da malária. Os investigadores determinarão a prevalência atual de reservatórios de Plasmodium humano em nossa comunidade e em nossos pacientes tratados pós-malária, tanto do tipo selvagem quanto de cepas mutantes/resistentes no King Faisal Hospital e unidades de saúde associadas. Determinaremos ainda aqueles associados à mutação no gene Kelch13 ou outros genes candidatos implicados na falha do tratamento.

Objetivos específicos;

1. Fornecer uma prova de conceito de que as infusões de Artemísia são eficientes e suficientes para esvaziar os reservatórios de Plasmodium humano em voluntários assintomáticos na comunidade e após o tratamento da malária.
2. Investigar agrupamentos domésticos de P. falciparum em pacientes com malária com menos de cinco anos, bem como em indivíduos infectados com cepas portadoras de mutações associadas à resistência ao tratamento, e explorar como a criação de um Registro Familiar de Malária pode ser usada como uma ferramenta para um melhor controle da doença em Ruanda
3. Avaliar a segurança de Artemisia afra e Artemisia annua por meio do monitoramento de exames bioquímicos de urina, rins (ureia, creatinina e eletrólitos) e testes de função hepática (transaminases, bilirrubina).
4. Investigar os potenciais profiláticos das infusões de Artemísia, uma vez que os reservatórios tenham sido limpos.
5. Avaliar a utilização e aceitabilidade do fitoterápico Artemisia em comunidades ruandesas.
6. Estudar o impacto socioeconômico da drenagem do reservatório de Plasmodium humano na comunidade de Ruanda.

4. Metodologia

Cenário do estudo O estudo será realizado em pacientes que buscam atendimento médico para malária no Hospital King Faisal, unidades de saúde associadas, CHUB, bem como na comunidade voltada para portadores assintomáticos de Plasmodium.

Desenho do estudo O estudo será conduzido como uma prova de conceito de ensaio aberto randomizado controlado usando randomização de blocos permutados/tamanhos variados aleatórios. Os investigadores irão recrutar pelo menos 125 participantes dentro de 14 dias após a conclusão do tratamento padrão da malária. Os pacientes serão solicitados a assinar um consentimento informado e uma PCR/RT-PCR será realizada para testar reservatórios de P. falciparum. Usaremos um limite de ciclo de corte de PCR em tempo real (qPCR) (valor de CT) superior ou igual a 40, que foi estabelecido com base em controle negativo africano e controles europeus que nunca foram expostos à malária antes. Amostras de sangue dos participantes recrutados também serão investigadas quanto a polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) no gene Kelch13 por meio do sequenciamento do domínio propulsor desse gene no qual foram relatadas mutações pontuais associadas à resistência à artemisinina. Em caso de ausência de SNP em K13, a busca por outra mutação genética associada à falha do tratamento será feita por sequenciamento do genoma completo e posteriormente abordada por ensaios laboratoriais de cultura do parasita. Dos participantes selecionados, cem (100) com parasitas residuais (reservatórios induzidos) serão divididos em 3 grupos: dois grupos de intervenção e 1 grupo de controle

Determinação do tamanho da amostra Os investigadores estão planejando um estudo de casos independentes e controles com 1 controle para 2 casos. Dados preliminares indicam que a taxa de falha entre os controles é ≥ 0,75. Se a verdadeira taxa de falha para indivíduos tratados for ≤ 0,25, precisamos estudar pelo menos 40 indivíduos de tratamento e 20 controles para detectar essa diferença com um poder de 95% a um nível de significância de 0,05. Assim, necessitaremos de 40 pacientes em cada grupo de intervenção e 20 controles, totalizando 100. Para randomizar 100, planejamos rastrear pelo menos 125 pacientes durante nosso período de recrutamento definido. Com base no fato de que as crianças menores de 5 anos são as mais vulneráveis ​​com a maior mortalidade e morbidade associadas à malária e não participarão de nossos ensaios clínicos, iremos recrutá-las como casos índices para nossa pesquisa de agregados familiares. Os membros da família dessas crianças serão, portanto, rastreados usando PCR para estabelecer o status dos reservatórios de plasmódio e verificar se há mutações significativas no plasmódio circulando na casa. Reservatórios confirmados em membros adultos da família que consentirem serão tratados com chá de artemísia.

População do estudo Para a abordagem clínica, o estudo irá recrutar adultos entre os 18 e os 65 anos para a prova de conceito do chá Artemisia entre 15 de abril de 2023 e 30 de junho de 2026. No entanto, com base no facto de as crianças com menos de 5 anos serem as mais vulneráveis ​​com a maior mortalidade, as crianças com menos de 5 anos tratadas pós-malária serão incluídas como casos índices para o nosso inquérito de agregados familiares e desenvolvimento do registo familiar. Embora as crianças não sejam incluídas neste estudo inicial de prova de conceito, pretendemos desenvolver formulações galénicas adequadas à faixa etária pediátrica numa fase posterior.

Para a abordagem comunitária, os membros assintomáticos da família serão rastreados usando PCR/RT-PCR para estabelecer o status dos reservatórios de Plasmodium e verificar se há alguma mutação no Plasmodium residual circulando na casa. Com base nisso, um registro familiar em torno dos casos-índice de crianças pequenas será construído como uma ferramenta de rastreamento e chá de Artemísia será fornecido aos adultos com o objetivo de eliminar os reservatórios de aglomerados domésticos. Em seguida, acompanharemos um período de pelo menos 6 meses para ver se há diferenças entre as crianças cujos grupos familiares foram tratados com as infusões e as que não foram com relação às infecções por malária. Isso será testado como uma medida potencial adicional de vigilância e controle da malária.

Para investigar melhor se as infusões de Artemísia poderiam possuir potencial profilático, pretendemos prosseguir o estudo com os participantes já inscritos, alterando a posologia. Os 75% dos participantes com reservatório esvaziado serão randomizados em 3 grupos: o primeiro grupo de 12 participantes procederá com chá de Artemísia uma xícara (335 ml) de 10g/L (A. afra) ou 10g/L (A. annua) todos os dias; o segundo grupo de 12 participantes receberá chá de Artemísia uma xícara (335 ml) de 10g/L (A. afra) ou 10g/L (A. annua) uma vez por semana; o último grupo de 6 participantes será o controle. Se as infusões de Artemisia com A. afra ou A. annua bloquearem o reservatório de Plasmodium em mais de 75% dos participantes em comparação com menos de 25% dos controles, então o estudo terá um poder de 95% para detectar uma diferença entre o grupo profilático e os controles a um nível de significância de 0,025.

Para monitorar a toxicidade, testes de função renal e hepática serão investigados no início e após 14 dias do chá de Artemísia, bem como mensalmente durante a fase profilática de pelo menos 6 meses.

Para abordar a aceitabilidade e o impacto das intervenções de pesquisa, serão realizadas pesquisas apropriadas.

Gerenciamento e análise de dados Todos os dados serão tratados usando princípios de confidencialidade padrão e gerenciados com EpiInfo e analisados ​​usando pacotes de software STATA 17. Os participantes serão descritos com base em suas características sociodemográficas como médias e desvios padrão para variáveis ​​contínuas ou proporções para variáveis ​​categóricas. Uma análise de intenção de tratar (ITT) usando duas proporções de amostra será usada para determinar as chances do reservatório de plasmódio ser esvaziado. A análise de sobrevida com regressão de Cox será realizada para avaliar o tempo de esvaziamento do reservatório de plasmódio e o tempo de recrudescência/reinfecção. Os dados serão comparados entre os grupos usando o teste qui-quadrado ou exato de Fischer após a verificação do menor valor esperado. Mudança média desde a linha de base As médias serão comparadas usando um teste paramétrico (t de Student ou ANOVA) ou não paramétrico (Mann-Whitney/Wilcoxon ou Kruskal-Wallis) após verificar a normalidade da distribuição e igualdade de variâncias.

Considerações éticas Todos os participantes do estudo terão uma explicação detalhada sobre o estudo e serão solicitados a assinar livremente um consentimento informado por escrito. A liberação de ética foi aprovada pelo Comitê Nacional de Ética de Ruanda (120/RNEC/2022, maio de 2022, alterado em outubro de 2022). O pedido de liberação da Autoridade de Alimentos e Medicamentos de Ruanda foi iniciado.