Affrontare i serbatoi di plasmodio asintomatici per accelerare l'eliminazione e l'eradicazione della malaria in Ruanda.

Secondo il rapporto mondiale sulla malaria 2021 dell'Organizzazione mondiale della sanità (OMS), nel 2020 ci sono stati 241 milioni di casi di malaria, con 627.000 decessi stimati durante lo stesso anno, con un aumento di 69.000 decessi rispetto all'anno precedente. Il continente africano continua a sostenere una quota sproporzionatamente elevata del carico globale di malaria. Nel 2020 la Regione ha ospitato il 95% di tutti i casi di malaria e il 96% dei decessi. I bambini sotto i 5 anni rappresentano circa l'80% di tutti i decessi per malaria nella Regione. Nonostante gli ammirevoli progressi nei primi 15 anni di questo secolo, ci sono state battute d'arresto per quanto riguarda il raggiungimento dell'eliminazione della malaria.

La malaria è un'infezione trasmessa da vettori parassitari causata da specie di Plasmodium. Quattro specie umane principali sono: P. falciparum, la specie più virulenta e predominante nell'Africa subsahariana, P. Ovale, P. vivax e P. malariae, e una specie zoonotica P. knowlesi. È una malattia responsabile di un impatto sanitario e socio-economico catastrofico dovuto principalmente al Plasmodium falciparum, che è responsabile di una notevole morbilità e mortalità soprattutto nei bambini sotto i cinque anni e nelle donne in gravidanza.

Quando una zanzara Anopheles portatrice di Plasmodium assume un pasto di sangue su un individuo, la saliva viene iniettata insieme agli sporozoiti, che migrano verso il fegato, iniziando così un ciclo. Una volta che l'uomo viene infettato, il ciclo epatico dura da 10 a 14 giorni (nel caso di P. falciparum), dopodiché migliaia di merozoiti a riproduzione asessuata vengono rilasciati nel sangue periferico dove invadono e si sviluppano all'interno degli eritrociti maturi. I parassiti dello stadio sanguigno sono quelli che causano i sintomi della malaria. In uno schema continuo, durante la replicazione asessuata nel flusso sanguigno, una piccola parte dei parassiti subisce uno sviluppo sessuale che dura circa 10 giorni nel caso di P. falciparum, con conseguente produzione di forme di gametociti trasmissibili. Questi gametociti responsabili della trasmissione del parassita dall'uomo al vettore della zanzara, sono insensibili alla maggior parte dei farmaci antimalarici convenzionali e sono spesso longevi (durata della vita della popolazione fino a 55 giorni dopo una terapia antimalarica di successo), garantendo così la trasmissione della malaria per diverse settimane. Interrompere la trasmissione della malaria richiede quindi lo sviluppo di nuovi farmaci anti-gametociti con profili di sicurezza che consentano campagne di trattamento a livello di popolazione.

Il Ruanda ha fatto passi da gigante negli ultimi due decenni investendo strategicamente nel rafforzamento del sistema sanitario, aumentando l'accesso alle cure istituendo un'assicurazione sanitaria basata sulla comunità, con conseguente sostanziale diminuzione del carico di malattia. Tuttavia, dal 2012, il paese ha registrato una persistente recrudescenza della malaria. Dal 2012 al 2018, l'incidenza della malaria è aumentata significativamente da 48 per 1000 a 403 per 1000, un aumento di quasi 10 volte. Entro il 2019-2020, il numero di casi è stato ridotto di oltre la metà, a 198 per 1000. Sebbene la trasmissione sia eterogenea in Ruanda, l'intera popolazione è considerata a rischio di malaria. La specie primaria di Plasmodium (P.) trovata in Ruanda, l'agente responsabile di questa malattia, è P. falciparum, ma sono state identificate anche P. malariae e P. ovale e questo è principalmente nella città cosmopolita di Kigali che riceve frequenti viaggiatori e turisti.

Nonostante i progressi compiuti, le recenti impennate e le preoccupazioni per la crescente resistenza ai farmaci richiedono meccanismi più dinamici, accessibili, convenienti e adattivi per combattere e potenzialmente eliminare la malaria tutti insieme. Nell'ultimo decennio sono state istituite diverse misure di sanità pubblica che tentano di sradicare la malaria, ma questo obiettivo rimane sfuggente fino ad oggi e il paese, e come la maggior parte dell'Africa sub-sahariana, il Ruanda continua ad affrontare un elevato carico di mortalità e morbilità per malaria.

In Ruanda, e in molti altri ambienti domestici africani, le famiglie hanno spesso sia bambini piccoli che nonni anziani che vivono insieme. Quando un membro della famiglia ha serbatoi di Plasmodium, questo mette sia i bambini più piccoli che i membri più vulnerabili della famiglia più grandi a rischio di infezioni ricorrenti di malaria grave. L'importanza dei portatori domestici asintomatici nel sostenere la trasmissione della malaria è stata evidenziata sia nel sud-est asiatico che in Africa.

Le misure di controllo della malaria attualmente implementate includono l'uso selettivo di varie strategie raccomandate dall'OMS come il controllo dell'allevamento di zanzare, la diagnosi tempestiva e la gestione dei casi, nonché l'uso della chemioprofilassi per gruppi di popolazione altamente vulnerabili come bambini sotto i 5 anni, donne incinte e visitatori provenienti da zone non endemiche. Ciò ha fornito alcuni vantaggi nella riduzione degli oneri della malaria a livello globale negli ultimi anni e, generando maggiori speranze per l'eliminazione/eradicazione della malaria nel prossimo futuro. Tuttavia, tali guadagni sono gravemente minacciati dall'emergere e dalla diffusione mondiale della resistenza sia agli insetticidi che ai farmaci antimalarici. La resistenza alla terapia combinata con artemisinina (ACT), il trattamento di prima linea raccomandato dall'OMS, è evidente nel sud-est asiatico ed è stata segnalata anche nei paesi africani. L'eliminazione della malaria richiederà quindi lo sviluppo di approcci e strumenti innovativi, comprese nuove opzioni terapeutiche e misure di controllo dei vettori.

Durante il 2021, l'OMS ha raccomandato l'uso del vaccino contro la malaria RTS, S/S2 per la prevenzione della malaria da P. falciparum nei bambini che vivono in regioni con trasmissione da moderata ad alta come definito dall'OMS. Tuttavia, gli studi di fase 3 hanno mostrato un'efficacia relativamente scarsa e il fatto che è improbabile che il vaccino stesso raggiunga l'obiettivo dell'eradicazione della malaria da solo. Con ulteriori vaccini candidati in cantiere che vengono valutati negli studi sui vaccini, c'è la speranza che continuino a essere sviluppati bersagli parassiti alternativi e strategie di vaccinazione. Un altro positivo recente è da RTS combinato, vaccino S/S2 e chemioprevenzione che ha dimostrato che questo approccio non era inferiore alla sola chemioprevenzione nella prevenzione della malaria non complicata. La combinazione di questi interventi ha comportato una minore incidenza di malaria non complicata, malaria grave e morte per malaria rispetto a ciascun intervento da solo.

Più recentemente, un nuovo vaccino R21 è stato sottoposto a studi di fase 2. Nonostante sia simile a RTS, S2, fonde insieme un antigene dell'epatite B e metà della proteina circumsporozoite, una porzione maggiore rispetto a RTS, S2. Gli sviluppatori credevano che questa combinazione sarebbe stata efficace almeno quanto RTS, S, ma meno costosa. In uno studio di fase 2b in doppio cieco, randomizzato, controllato, un vaccino R21 a base di proteina circumsporozoita a basso dosaggio è stato somministrato a bambini di età compresa tra 5 e 17 mesi a Nanoro, Burkina Faso, con due diverse dosi di adiuvante Matrix-M (MM ). R21/MM appare sicuro e significativamente immunogenico in questa coorte di bambini africani e mostra un'efficacia promettente.

Sono stati condotti ulteriori studi sui vaccini con il vaccino Plasmodium falciparum sporozoite (PfSPZ) attenuato dalle radiazioni, ipotizzato per fornire protezione contro l'infezione da P. falciparum negli adulti e nei bambini naïve alla malaria. Studi preclinici mostrano che l'immunità mediata da cellule T è necessaria per la protezione ed è prontamente indotta negli esseri umani dopo la vaccinazione. Non c'era, tuttavia, alcuna protezione significativa contro l'infezione da P. falciparum in qualsiasi gruppo di dose a 6 mesi, che era l'endpoint primario dello studio.

La malaria asintomatica è prevalente nelle regioni endemiche e durante tutte le stagioni e l'identificazione spesso richiede l'uso di strumenti diagnostici altamente sensibili, inclusi approcci molecolari come la PCR. L'eliminazione della malaria nelle aree con trasmissione stabile della malaria richiederà quindi l'uso sostenibile di approcci integrati vettore-parassita mirati sia ai serbatoi asintomatici umani che ai serbatoi di vettori, prestando attenzione alla tossicità dei farmaci e garantendo che la resistenza non sia ulteriormente peggiorata.

La letteratura mostra che i serbatoi asintomatici possono essere eliminati nei programmi di trattamento di massa. In passato, diverse strategie di trattamento di massa (Mass drug administration (MDA)) sono state proposte e provate a dimostrare di ridurre rapidamente la malaria, in particolare nelle regioni con trasmissione stagionale della malaria in alcune parti dell'Africa e in Cina. Sfortunatamente, l'uso di ACT nel trattamento diretto dalla comunità della malaria asintomatica pone una sfida, non solo dalla resistenza ai farmaci, ma anche dall'osservazione del potenziamento della proliferazione dei gametociti dopo le somministrazioni di ACT. Contrariamente alle sfide sopra riportate degli ACT da utilizzare nella MDA, gli studi in vitro hanno dimostrato che le infusioni di Artemisia annua e Artemisia afra o le foglie in polvere erano efficaci, dove entrambe hanno chiaramente dimostrato una potente inibizione della parassitemia e della gametocitemia. È stato inoltre dimostrato che Artemisia annua contiene non solo artemisinina ma anche altri componenti che dimostrano un complesso sinergico effetto antimalarico. Artemisia afra non contiene artemisinina. In un recente studio clinico in doppio cieco sull'uomo e in altri studi precedenti, entrambe le piante sono state segnalate per curare stabilmente la malaria, compresi i casi resistenti all'ACT e uccidere le forme di gametociti trasmissibili. Il loro potenziale chemioprotettivo è stato osservato anche in questi e altri studi.

Riteniamo che per ottenere efficacemente l'eliminazione della malaria in Ruanda, sia fondamentale indirizzare il serbatoio umano di P. falciparum utilizzando infusioni di Artemisia locali e prontamente disponibili. Le infezioni asintomatiche rilevabili mediante PCR sono un serbatoio importante perché spesso persistono per mesi e ospitano gametociti, lo stadio del parassita infettivo per le zanzare.

III. Obiettivi della ricerca Obiettivo generale; Per fornire una prova del concetto che le infusioni di Artemisia, sia annua che afra, sono efficaci e sufficienti per eliminare i serbatoi residui di Plasmodium dopo il trattamento della malaria. Gli investigatori determineranno l'attuale prevalenza dei serbatoi umani di Plasmodium nella nostra comunità e nei nostri pazienti trattati post malaria, sia di tipo selvaggio che di ceppi mutati/resistenti presso il King Faisal Hospital e le strutture sanitarie associate. Determinaremo ulteriormente quelli associati alla mutazione nel gene Kelch13 o altri geni candidati implicati nel fallimento del trattamento.

Obiettivi specifici;

1. Fornire una prova del concetto che le infusioni di Artemisia sono efficienti e sufficienti per svuotare i serbatoi umani di Plasmodium in volontari asintomatici in comunità e dopo il trattamento della malaria.
2. Indagare i cluster domestici di P. falciparum nei pazienti affetti da malaria di età inferiore ai cinque anni e negli individui infetti da ceppi portatori di mutazioni associate alla resistenza al trattamento ed esplorare come la progettazione di un registro familiare della malaria possa essere utilizzata come strumento per un migliore controllo della malattia in Ruanda
3. Valutare la sicurezza di Artemisia afra e Artemisia annua monitorando i test chimici delle urine, dei reni (urea, creatinina ed elettroliti) e dei test di funzionalità epatica (transaminasi, bilirubina).
4. Per studiare i potenziali profilattici delle infusioni di Artemisia una volta che i serbatoi sono stati liberati.
5. Valutare l'utilizzo e l'accettabilità della fitoterapia Artemisia nelle comunità ruandesi.
6. Studia l'impatto socio-economico del drenaggio del serbatoio umano di Plasmodium nella comunità ruandese.

IV. Metodologia

Contesto dello studio Lo studio sarà condotto su pazienti in cerca di cure mediche per la malaria presso il King Faisal Hospital, strutture sanitarie associate, CHUB, nonché nella comunità che si rivolge ai portatori asintomatici di Plasmodium.

Disegno dello studio Lo studio sarà condotto come prova di concetto aperto randomizzato controllato utilizzando randomizzazione a blocchi permutati/dimensioni variabili casuali. Gli investigatori recluteranno almeno 125 partecipanti entro 14 giorni dal completamento del trattamento standard contro la malaria. Ai pazienti verrà chiesto di firmare il consenso informato e verrà eseguita una PCR/RT-PCR per testare i serbatoi di P. falciparum. Useremo una soglia del ciclo di interruzione della PCR in tempo reale (qPCR) (valore CT) superiore o uguale a 40, che è stata stabilita sulla base di controlli africani negativi e controlli europei che non sono mai stati esposti alla malaria prima. I campioni di sangue dei partecipanti reclutati saranno anche studiati per polimorfismi a singolo nucleotide (SNP) nel gene Kelch13 sequenziando il dominio dell'elica di questo gene all'interno del quale sono state riportate mutazioni puntiformi associate alla resistenza all'artemisinina. In caso di assenza di SNP in K13, la ricerca di altre mutazioni geniche associate al fallimento del trattamento sarà effettuata mediante sequenziamento dell'intero genoma e ulteriormente affrontata mediante analisi di colture parassitarie di laboratorio. Dai partecipanti selezionati, cento (100) con parassiti residui (serbatoi indotti) verranno quindi assegnati a 3 gruppi: due gruppi di intervento e 1 gruppo di controllo

Determinazione della dimensione del campione Gli investigatori stanno pianificando uno studio di casi e controlli indipendenti con 1 controllo per 2 casi. I dati preliminari indicano che il tasso di fallimento tra i controlli è ≥ 0,75. Se il vero tasso di fallimento per i soggetti trattati è ≤ 0,25, dobbiamo studiare almeno 40 soggetti in trattamento e 20 controlli per rilevare tale differenza con una potenza del 95% a un livello di significatività di 0,05. Avremo quindi bisogno di 40 pazienti in ciascun gruppo di intervento e 20 controlli, per un totale di 100. Per poterne randomizzare 100, prevediamo di sottoporre a screening almeno 125 pazienti durante il nostro periodo di reclutamento stabilito. Sulla base del fatto che i bambini sotto i 5 anni sono i più vulnerabili con la più alta mortalità e morbilità associate alla malaria e non parteciperanno ai nostri studi clinici, li recluteremo come casi indice per la nostra indagine sui cluster domestici. I membri della famiglia di questi bambini saranno quindi sottoposti a screening mediante PCR per stabilire lo stato dei serbatoi di plasmodio e per accertare se vi sono mutazioni significative all'interno del plasmodio circolante in casa. I serbatoi confermati nei membri adulti della famiglia che acconsentono saranno trattati con il tè di Artemisia.

Popolazione dello studio Per l'approccio clinico, lo studio recluterà adulti tra i 18 e i 65 anni per l'intervento di dimostrazione del concetto di tè Artemisia tra il 15 aprile 2023 e il 30 giugno 2026. Tuttavia, sulla base del fatto che i bambini sotto i 5 anni sono i più vulnerabili con la mortalità più alta, i bambini sotto i 5 anni che hanno subito la malaria saranno inclusi come casi indice per la nostra indagine sui gruppi di famiglie e lo sviluppo del registro familiare. Anche se i bambini non saranno inclusi durante questo studio iniziale di proof of concept, intendiamo sviluppare formulazioni galeniche adatte alla fascia di età pediatrica in una fase successiva.

Per l'approccio di comunità, i membri asintomatici della famiglia saranno sottoposti a screening mediante PCR/RT-PCR per stabilire lo stato dei serbatoi di Plasmodium e per accertare se ci sono mutazioni all'interno del Plasmodium residuo circolante in casa. Sulla base di ciò, verrà costruito un registro familiare attorno ai casi indice dei bambini piccoli come strumento di tracciamento e il tè di Artemisia sarà somministrato agli adulti con l'obiettivo di eliminare i serbatoi del gruppo familiare. Seguiremo quindi un periodo di almeno 6 mesi per vedere se ci sono differenze tra i bambini i cui gruppi familiari sono stati trattati con le infusioni e quelli che non lo erano per quanto riguarda le infezioni da malaria. Questo sarà testato come un'ulteriore potenziale misura di sorveglianza e controllo della malaria.

Per indagare ulteriormente se le infusioni di Artemisia potrebbero possedere un potenziale profilattico, intendiamo proseguire lo studio con i partecipanti già arruolati modificando la posologia. Il 75% dei partecipanti con serbatoio svuotato sarà randomizzato in 3 gruppi: il primo gruppo di 12 partecipanti procederà con una tazza di tè Artemisia (335 ml) da 10 g/L (A. afra) o 10 g/L (A. annua) tutti i giorni; il secondo gruppo di 12 partecipanti riceverà una tazza di tè Artemisia (335 ml) da 10 g/L (A. afra) o 10 g/L (A. annua) una volta alla settimana; l'ultimo gruppo di 6 partecipanti sarà il controllo. Se le infusioni di Artemisia con A. afra o A. annua bloccano il serbatoio di Plasmodium si riempiono in più del 75% dei partecipanti rispetto a meno del 25% dei controlli, allora lo studio avrà una potenza del 95% per rilevare una differenza tra il gruppo profilattico e i controlli a un livello di significatività di 0,025.

Per monitorare la tossicità, i test di funzionalità renale ed epatica saranno studiati all'inizio e dopo 14 giorni di tè Artemisia, nonché mensilmente durante la fase profilattica di almeno 6 mesi.

Per affrontare l'accettabilità e l'impatto degli interventi di ricerca, saranno condotte indagini appropriate.

Gestione e analisi dei dati Tutti i dati saranno trattati utilizzando i principi di riservatezza standard e gestiti con EpiInfo e analizzati utilizzando i pacchetti software STATA 17. I partecipanti saranno descritti in base alle loro caratteristiche socio-demografiche come medie e deviazioni standard per variabili continue o proporzioni per variabili categoriali. Verrà utilizzata un'analisi per intenzione di trattare (ITT) utilizzando due proporzioni di campioni per determinare le possibilità che il serbatoio di plasmodio venga svuotato. Verranno effettuate analisi di sopravvivenza con regressione di Cox per valutare il tempo di svuotamento del serbatoio di plasmodio e il tempo di recrudescenza/reinfezione. I dati saranno confrontati tra i gruppi utilizzando il test Chi-quadrato o Fischer esatto dopo aver verificato il valore atteso più piccolo. Variazione media rispetto al basale Le medie saranno confrontate utilizzando un test parametrico (student t o ANOVA) o non parametrico (Mann-Whitney/Wilcoxon o Kruskal-Wallis) dopo aver verificato la normalità della distribuzione e l'uguaglianza delle varianze.

Considerazioni etiche Tutti i partecipanti allo studio avranno una spiegazione dettagliata sullo studio e richiesto di firmare liberamente un consenso informato scritto. L'autorizzazione etica è stata approvata dal comitato etico nazionale del Ruanda (120/RNEC/2022 maggio 2022, modificato nell'ottobre 2022). È stata avviata la domanda di autorizzazione della Rwanda Food and Drug Authority.