解决无症状疟原虫库以加速卢旺达消除和根除疟疾。

根据世界卫生组织 (WHO) 的《2021 年世界疟疾报告》，2020 年有 2.41 亿例疟疾病例，同年估计有 62.7 万人死亡，比上一年增加了 6.9 万人。 非洲大陆在全球疟疾负担中继续承担着不成比例的高份额。 2020 年，95% 的疟疾病例和 96% 的死亡病例都发生在该地区。 5 岁以下儿童约占该区域所有疟疾死亡人数的 80%。 尽管本世纪头 15 年取得了令人钦佩的进展，但在实现消除疟疾方面却遇到了挫折。

疟疾是由疟原虫属引起的寄生媒介传播感染。 四个主要的人类物种是：恶性疟原虫，撒哈拉以南非洲地区毒性最强和最主要的物种，P. Ovale，P. vivax 和 P. malariae，以及一种人畜共患物种 P. knowlesi。 它是一种造成灾难性健康和社会经济影响的疾病，主要是由于恶性疟原虫引起的，它导致大量的发病率和死亡率，尤其是在五岁以下儿童和孕妇中。

当携带疟原虫的按蚊吸食个体的血粉时，唾液与子孢子一起被注入，子孢子迁移到肝脏，从而开始一个循环。 一旦人类被感染，肝周期将持续 10 到 14 天（在恶性疟原虫的情况下），之后数以千计的无性繁殖裂殖子被释放到外周血中，在那里它们侵入成熟红细胞并在其中发育。 血液阶段寄生虫是那些引起疟疾症状的寄生虫。 在连续模式下，在血流中的无性复制过程中，一小部分寄生虫在恶性疟原虫的情况下经历持续大约 10 天的性发育，导致产生可传播的配子体形式。 这些负责将寄生虫从人类传播到蚊子媒介的配子体对大多数常规抗疟药不敏感，并且通常寿命很长（成功抗疟治疗后人口寿命长达 55 天），从而确保疟疾传播数周。 因此，阻断疟疾传播需要开发具有安全性的新型抗配子体药物，以便在全人群范围内开展治疗活动。

在过去的二十年里，卢旺达通过战略性投资加强卫生系统，通过建立以社区为基础的健康保险增加获得医疗服务的机会，从而使疾病负担大幅下降，取得了长足的进步。 然而，自 2012 年以来，该国一直在经历疟疾的持续高涨。 从 2012 年到 2018 年，疟疾发病率从每 1000 人 48 人显着增加到每 1000 人 403 人，增长了近 10 倍。 到 2019-2020 年，病例数减少了一半以上，降至每千人 198 例。 尽管卢旺达的传播方式存在异质性，但整个人口都被认为有患疟疾的风险。 在卢旺达发现的主要疟原虫 (P.) 物种是恶性疟原虫，是导致这种疾病的病原体，但也发现了疟疾疟原虫和卵形疟原虫，这主要发生在国际化的主要城市基加利，该城市经常受到旅行者和游客。

尽管取得了进展，但最近的高潮和对日益增长的耐药性的担忧需要更有活力、更容易获得、成本效益更高和适应性更强的机制来对抗并有可能一起消除疟疾。 在过去十年中，制定了多项试图根除疟疾的公共卫生措施，但迄今为止这一目标仍然难以实现，该国与大多数撒哈拉以南非洲国家一样，继续面临疟疾死亡率和发病率的高负担。

在卢旺达和许多其他非洲家庭环境中，家庭经常有年幼的孩子和年迈的祖父母住在一起。 当家庭成员携带疟原虫宿主时，年幼的孩子和年长的更脆弱的家庭成员都面临反复感染严重疟疾的风险。 东南亚和非洲都证明了无症状家庭携带者在维持疟疾传播方面的重要性。

目前部署的疟疾控制措施包括选择性使用世卫组织推荐的各种策略，如控制蚊子繁殖、及时诊断和病例管理，以及对高度脆弱的人群（如 5 岁以下儿童、孕妇和儿童）进行化学预防。来自非流行区的游客。 近年来，这在减轻全球疟疾负担方面取得了一些进展，并为在不久的将来消除/根除疟疾带来了更多希望。 然而，这些成果受到杀虫剂和抗疟药耐药性的出现和全球传播的严重威胁。 青蒿素联合疗法 (ACT) 是世卫组织推荐的一线治疗药物，其耐药性在东南亚很明显，非洲国家也有报道。 因此，消除疟疾需要开发创新方法和工具，包括新的治疗方案和病媒控制措施。

在 2021 年期间，世界卫生组织建议使用 RTS、S/S2 疟疾疫苗来预防生活在世界卫生组织定义的中度至高度传播地区的儿童的恶性疟原虫疟疾。 然而，3 期试验显示效果相对较差，而且疫苗本身不太可能实现根除疟疾的目标。 随着正在疫苗试验中评估的更多候选疫苗正在准备中，有望继续开发替代寄生虫目标和疫苗接种策略。 另一个最近的积极成果来自联合 RTS、S/S2 疫苗和化学预防，表明这种方法在预防无并发症的疟疾方面不劣于单独的化学预防。 这些干预措施的组合导致无并发症疟疾、严重疟疾和疟疾死亡的发生率低于单独的每种干预措施。

最近，一种新型疫苗 R21 正在进行二期试验。 尽管与 RTS, S2 相似，但它融合了乙型肝炎抗原和一半的环子孢子蛋白——比 RTS, S2 中的部分更大。 开发人员认为，这种组合至少与 RTS、S 一样有效，而且成本更低。 在一项双盲、随机、对照、2b 期试验中，布基纳法索 Nanoro 的 5-17 个月儿童接种了一种基于环子孢子蛋白的低剂量 R21 疫苗，并使用两种不同剂量的佐剂 Matrix-M (MM ). R21/MM 在这组非洲儿童中显得安全且具有显着的免疫原性，并显示出有前途的疗效。

已经对辐射减毒的恶性疟原虫子孢子 (PfSPZ) 疫苗进行了更多疫苗试验，该疫苗被假设可以为未接触过疟疾的成人和儿童提供针对恶性疟原虫感染的保护。 临床前研究表明，T 细胞介导的免疫是保护所必需的，并且在接种疫苗后很容易在人体中诱导。 然而，在作为研究的主要终点的 6 个月时，任何剂量组都没有针对恶性疟原虫感染的显着保护作用。

无症状疟疾在流行地区和所有季节都很普遍，识别它们通常需要使用高度敏感的诊断工具，包括 PCR 等分子方法。 因此，在疟疾传播稳定的地区消除疟疾需要可持续地使用针对人类无症状宿主和媒介宿主的媒介-寄生虫综合方法，同时注意药物的毒性，并确保耐药性不会进一步恶化。

文献表明，可以在大规模治疗方案中消除无症状的宿主。 过去，已经提出并尝试证明可以快速减少疟疾的多种大规模治疗策略（大规模药物管理（MDA）），特别是在非洲部分地区和中国的季节性疟疾传播地区。 不幸的是，在无症状疟疾的社区指导治疗中使用 ACT 提出了挑战，不仅来自耐药性，而且观察到 ACT 给药后配子体增殖的增强。 与上述报道的 ACT 用于 MDA 的挑战相反，体外研究表明青蒿和非洲蒿浸液或粉状叶是有效的，两者都清楚地证明了对寄生虫血症和配子体血症的有效抑制。 还表明，青蒿不仅含有青蒿素，还含有其他具有协同复合抗疟作用的成分。 Artemisia afra 不含任何青蒿素。 在最近的一项人体双盲临床试验和之前的其他研究中，据报道这两种植物都能稳定治愈疟疾，包括 ACT 耐药病例以及杀死可传播的配子体形式。 在这些和其他研究中也观察到了它们的化学保护潜力。

我们认为，为了在卢旺达有效地消除疟疾，使用当地和现成的艾蒿输液来瞄准恶性疟原虫的人类宿主至关重要。 可通过 PCR 检测到的无症状感染是一个重要的宿主，因为它们通常会持续数月并且含有配子体，即对蚊子具有传染性的寄生虫阶段。

三、研究目标 总体目标；提供概念证明，青蒿和非洲蒿输注液有效且足以消除疟疾治疗后残留的疟原虫库。 研究人员将确定费萨尔国王医院和相关医疗机构的人类疟原虫库目前在我们社区和疟疾治疗后患者中的流行情况，包括野生型和突变/耐药株。 我们将进一步确定与 Kelch13 基因或其他与治疗失败有关的候选基因突变相关的那些。

具体的目标;

1. 提供概念证明，即艾蒿输液有效且足以清空社区无症状志愿者和疟疾治疗后的人类疟原虫库。
2. 调查 5 岁以下老年疟疾患者以及感染携带与治疗耐药性相关突变的菌株的恶性疟原虫家庭群，并探索如何将疟疾家庭登记工程设计用作更好地控制卢旺达疾病的工具
3. 通过监测尿液化学测试、肾脏（尿素、肌酐和电解质）和肝功能测试（转氨酶、胆红素）来评估非洲蒿和青蒿的安全性。
4. 研究清除水库后艾蒿输液的预防潜力。
5. 评估蒿草药在卢旺达社区的利用和可接受性。
6. 研究卢旺达社区人类疟原虫水库排水的社会经济影响。

四、方法

研究环境 该研究将针对在 King Faisal 医院、相关医疗机构、CHUB 以及针对无症状疟原虫携带者的社区寻求疟疾医疗的患者进行。

研究设计 该研究将作为概念证明开放式随机对照试验使用置换块随机化/随机变化大小进行。 研究人员将在完成标准疟疾治疗后的 14 天内招募至少 125 名参与者。 将要求患者签署知情同意书，并将进行 PCR/RT-PCR 以测试恶性疟原虫宿主。 我们将使用高于或等于 40 的实时 PCR (qPCR) 截止循环阈值（CT 值），该阈值是根据以前从未接触过疟疾的阴性非洲对照和欧洲对照建立的。 来自招募参与者的血液样本也将通过对该基因的螺旋桨结构域进行测序来研究 Kelch13 基因中的单核苷酸多态性 (SNP)，其中已报道与青蒿素抗性相关的点突变。 如果 K13 中没有 SNP，将通过全基因组测序来寻找与治疗失败相关的其他基因突变，并通过实验室寄生虫培养分析进一步解决。 从筛选的参与者中，一百 (100) 名残留寄生虫（诱导宿主）将被分配到 3 组：两个干预组和 1 个对照组

样本量确定 研究人员计划对独立病例和对照进行研究，其中 1 个对照用于 2 个病例。 初步数据表明，控件之间的失败率≥ 0.75。 如果治疗对象的真实失败率≤ 0.25，我们需要研究至少 40 个治疗对象和 20 个对照，以便在 0.05 的显着性水平下以 95% 的功效检测这种差异。 因此，我们需要每个干预组 40 名患者和 20 名对照组，总共 100 名。 为了让 100 人随机化，我们计划在我们设定的招募期间筛选至少 125 名患者。 基于 5 岁以下儿童是疟疾相关死亡率和发病率最高的最脆弱人群并且不会参加我们的临床试验这一事实，我们将招募他们作为我们家庭集群调查的指标案例。 因此，将使用 PCR 对这些儿童的家庭成员进行筛查，以确定疟原虫宿主的状况，并确定在家中传播的疟原虫中是否存在任何重要突变。 同意的成年家庭成员中确认的储存库将使用艾蒿茶进行治疗。

研究人群 对于临床方法，该研究将在 2023 年 4 月 15 日至 2026 年 6 月 30 日期间招募 18 至 65 岁的成年人进行艾蒿茶概念干预验证。 但是，基于 5 岁以下儿童是最脆弱、死亡率最高的这一事实，我们将把 5 岁以下接受过疟疾治疗的儿童作为指标案例纳入我们的家庭集群调查和家庭登记开发。 虽然最初的概念验证研究中不包括儿童，但我们打算在后期开发适合儿科年龄组的盖伦制剂。

对于去社区方法，将使用 PCR/RT-PCR 对无症状的家庭成员进行筛查，以确定疟原虫宿主的状态，并确定在家中循环的残留疟原虫中是否存在任何突变。 以此为基础，围绕少儿指标病例建立家庭登记表，作为追踪工具，对成人施以艾茶，消除家庭聚集性蓄积。 然后，我们将在至少 6 个月的时间里进行跟踪，以了解在疟疾感染方面，家庭集群接受过输液治疗的儿童与未接受过输液治疗的儿童之间是否存在任何差异。 这将作为一项额外的潜在疟疾监测和控制措施进行测试。

为了进一步研究艾蒿输液是否具有预防潜力，我们打算通过改变剂量学对已经登记的参与者进行研究。 75% 的水库已排空的参与者将被随机分为 3 组：第一组 12 名参与者将继续服用一杯 10g/L (A. afra) 或 10g/L (A. annua）每天；第二组 12 名参与者将获得 10g/L (A. afra) 或 10g/L (A. annua）每周一次；最后一组 6 名参与者将作为对照组。 如果含有 A. afra 或 A. annua 的艾蒿输液阻断了超过 75% 的参与者的疟原虫储库，而对照组的这一比例不到 25%，那么该研究将有 95% 的功效来检测两者之间的差异预防组和对照组的显着性水平为 0.025。

为了监测毒性，将在艾蒿茶开始和服用 14 天后以及至少 6 个月的预防阶段每月进行一次肾和肝功能测试。

为了解决研究干预措施的可接受性和影响，将进行适当的调查。

数据管理和分析 所有数据都将使用标准保密原则进行处理，并使用 EpiInfo 进行管理，并使用 STATA 17 软件包进行分析。 参与者将根据他们的社会人口特征描述为连续变量的均值和标准差或分类变量的比例。 使用两个样本比例的意向治疗 (ITT) 分析将用于确定疟原虫库被清空的机会。 将使用 cox 回归进行生存分析，以评估疟原虫库排空时间和复发/再感染时间。 在检查最小预期值后，将使用卡方检验或 Fischer 精确检验对组间数据进行比较。 在检查分布的正态性和方差相等性后，将使用参数（学生 t 或方差分析）或非参数（Mann-Whitney/Wilcoxon 或 Kruskal-Wallis）检验比较均值与基线的变化。

伦理考虑 所有研究参与者都将对研究进行详细解释，并要求自由签署书面知情同意书。 道德许可已获得卢旺达国家道德委员会的批准（120/RNEC/2022，2022 年 5 月，2022 年 10 月修订）。 卢旺达食品和药物管理局的许可申请已经启动。