Synergie stravy v syntéze svalových bílkovin (POTATO)

1. Předběžné testování

   1.1 Přípravy: Účastníci dorazí na předběžné testování po nočním půstu (~10 h bez kalorických potravin/nápojů) a po zdržení se cvičení 72 h předem. Před jakýmikoliv osobními procedurami budou účastníci seznámeni s postupy a riziky spojenými s účastí prostřednictvím prostudování informovaného souhlasu. Účastníkům bude doporučeno klást otázky a získat na ně odpovědi předtím, než budou požádáni, zda chtějí pokračovat. Potvrzení bude zaznamenáno podpisem na formuláři procesu informovaného souhlasu.

   1.2 Antropometrie: Po poskytnutí souhlasu bude změřená výška a hmotnost účastníků, aby se potvrdilo, že index tělesné hmotnosti (BMI) je v rámci limitů způsobilosti (18,5 - 30 kg/m^2). Protože účastníci již byli posouzeni na všechny ostatní inkluzní a exkluzní kritéria, způsobilé BMI povede k zařazení do studie a pokračování předběžného testování. Po potvrzení způsobilosti pro studii bude krevní tlak změřen vyškoleným členem výzkumného týmu. Následně bude tělesné složení stanoveno pomocí dvouenergiové rentgenové absorpciometrie (DEXA) v souladu s doporučeními výrobce. Stručně řečeno, účastníci budou požádáni, aby před umístěním vyškoleným technikem odstranili všechny kovové předměty z těla pro přesné měření beztukové tělesné hmoty a tukové hmoty. Skenování trvá přibližně 6-10 minut, během kterých bude účastník instruován, aby zůstal nehybný.

   1.3 Záznam obvyklé stravy: Současné stravovací návyky budou hodnoceny prostřednictvím online automatizovaného samovyplňovaného (ASA24) systému záznamu stravy. Účastníci obdrží své individuální uživatelské jméno a heslo během této sezení a bude jim řečeno, aby zaznamenávali po dobu 3 po sobě jdoucích dnů (2 pracovní dny a 1 víkendový den) před každým pokusem. Protože je systém online, účastníci jej mohou vyplnit mimo místo konání ve svém volném čase.

   1.4 Klidový metabolický výdej: Klidový metabolický výdej (RMR) bude hodnocen pomocí nepřímé kalorimetrie. Jedná se o netělesně náročný test, při kterém se RMR měří pomocí automatizovaného systému analýzy plynů. Toto zařízení měří spotřebu kyslíku a produkci oxidu uhličitého jako rozdíl mezi vdechovanými a vydechovanými koncentracemi plynů. Před zahájením testu budou účastníci ležet na zádech na stole a čirá, tvrdá plastová kapuce a měkká, čirá plastová zástěra budou umístěny na krk, hlavu a ramena účastníka, aby zachytily vydechované plyny. Účastníci pak budou ležet nehybně, aniž by usnuli, zatímco jsou zachycovány koncentrace respiračních plynů. Testování bude ukončeno, když je RMR stabilní po dobu alespoň 20 minut (obvykle ~30 minut od začátku).

   1.5 Testování deseti opakování maxima (10RM): Po testování klidového metabolického výdeje bude účastníkům testováno 10RM pro předkopávání a leg press. Pro začátek budou účastníci 5 minut šlapat na standardním cykloergometru vlastním tempem. Účastníci pak dokončí sérii 8-10 opakování při ~50 % jejich předpokládaného 10RM, následovanou 1-2 minutami odpočinku. Zátěž pak bude nastavena na ~90 % jejich předpokládaného 10RM. Zátěž bude zvýšena o 2,5-5,0 % po každém úspěšném pokusu až do selhání (obvykle do 5 pokusů). Mezi maximálními pokusy budou přiděleny dvě minuty odpočinku a mezi cviky 5 minut. Nejprve bude testováno předkopávání, následované leg pressem. Před opuštěním laboratoře bude účastníkům umožněno položit jakékoliv otázky, než se sezení ukončí.

   1.6 Akcelerometry: Před opuštěním laboratoře budou účastníkům poskytnuty akcelerometry (Actigraph) pro hodnocení úrovně denní fyzické aktivity (tj. počet kroků). Výzkumný personál předvede správné použití a instruuje účastníky, aby zařízení nosili po celou dobu trvání studie. Po předvedení bude účastníkům připomenuto, aby se zdrželi jakéhokoliv nadbytečného cvičení a nosili zařízení dva dny před pokusy.

   1.7 Plánování: Před opuštěním laboratoře účastníci a výzkumný tým určí datum pro první infuzní pokus (nejméně 7 dní po předběžném testování). Navíc výzkumný tým poskytne účastníkům standardizované jídlo ke konzumaci noc před první infuzí a instrukce, aby se zdrželi namáhavého cvičení a konzumace alkoholu 72 a 24 hodin před prvním pokusem. Účastníkům bude také nabídnuta svačina před opuštěním laboratoře.

2. Infuzní pokusy

2.1 Přípravy: Nejméně 7 dní po předběžném testování nebo předchozí infuzi budou účastníci požádáni, aby se vrátili do laboratoře na infuzní pokus. Ráno každé infuze dorazí účastníci do laboratoře ráno po nočním (~10 h bez kalorických potravin/nápojů) půstu a po zdržení se namáhavého cvičení a konzumace alkoholu po dobu 72 a 24 hodin. Po dobu 3 dnů předcházejících každému pokusu budou účastníci požádáni, aby zaznamenávali svůj příjem stravy prostřednictvím online automatizovaného samovyplňovaného (24hodinového) systému záznamu stravy (ASA24).

2.2 Infuze stabilních izotopů: Po příchodu do laboratoře budou účastníci ležet na zádech na klinickém lůžku, než jim bude zaveden intravenózní katétr do hřbetní žíly ruky nebo paže. Pro zavedení katétru nebude provedeno více než čtyři pokusy. Po odběru základní krve bude podána startovací dávka L-[1-13C] leucinu a L-[prsten 2H5] fenylalaninu před zahájením konstantní infuze pomocí kalibrované infuzní pumpy. Stabilní izotopové aminokyselinové stopovače použité v tomto experimentu nejsou radioaktivní a jsou zcela bezpečné. Tyto stabilní izotopy obohatí bazén aminokyselin v těle, což nám umožní identifikovat rychlost začlenění aminokyselin do tkání. Příprava stopovačů pro intravenózní podání proběhne v sterilním prostředí pod laminárním prouděním vzduchu určeným pro přípravu stopovačů a v souladu s pokyny Správné výrobní praxe.

2.3 Odběr krve: Poté, co výzkumníci zahájí infuzi, bude na druhé straně zaveden druhý katétr do žíly ruky nebo paže, aby výzkumníci mohli během pokusu odebírat krev. Během pokusu bude krev periodicky odebírána z katétru. Před odběrem některých vzorků bude na místo katétru (paže nebo ruka) umístěna vyhřívaná deka (60°C), aby se vzorky krve "arterializovaly" (napodobily krev v tepnách). Během prvního pokusu bude odebráno celkem 17 vzorků krve (~174 ml), zatímco ve druhém pokusu bude odebráno 15 vzorků krve (~149 ml). Pravidelný odběr krve umožňuje stanovení izotopového obohacení, koncentrací aminokyselin a koncentrací volných mastných kyselin v krvi. Mezi odběry bude katétr udržován průchodný pomocí 0,9% fyziologického roztoku kapajícího nízkou rychlostí.

2.4 VCO2: Produkce oxidu uhličitého (VCO2) bude stanovena z vydechovaného vzduchu odebraného otevřeným okruhem pomocí náustku připojeného k hadici. Ihned po provedení analýzy VCO2 (10 minut) budou účastníci požádáni, aby vydechli do samostatného náustku připojeného k plastovému sáčku. Tento dechový vzorek je uložen ve sterilní vakuové zkumavce pro budoucí analýzu obohacení stabilním izotopovým stopovačem v dechu.

2.5 Odběr svalové tkáně: Bude odebráno celkem pět svalových biopsií (tři jako součást 1. infuze a dvě během 2. infuze). Bioptický postup zahrnuje odstranění malého kousku svalové tkáně pomocí sterilní duté jehly (Bergströmova jehla) a bude proveden Dr. Nicholasem Burdem pod záštitou Dr. Jareda Willarda, MD. Účastníci budou odpočívat na lůžku a oblast pro biopsii bude oholena, pokud je to nutné. Následně bude oblast sterilizována pomocí 4% glukonátu chlorhexidinu, než bude podkožně injikováno 5 ml lokálního anestetika (2% Xylokain s 1:100 000 epinefrinu) se zvláštní péčí, aby se zabránilo infiltraci svalu. Jakmile anestetikum začne působit (~10 min), Dr. Burd provede malý řez (~4-5 mm) v kůži, aby vytvořil otvor, kterým bude zavedena bioptická jehla pro odběr tkáně. Dr. Burd rychle odřízne malý kousek svalu (~50-100 mg; přibližně velikost standardní gumy na tužku) a odstraní jehlu z nohy subjektu. Během odběru vzorku (~30 sekund) mohou subjekty cítit pocit hlubokého tlaku v noze. Pod stehno účastníka bude umístěn sterilní jednorázový zástěra a pro všechny bioptické postupy budou použity sterilní rukavice.

Po dokončení biopsie vyškolený člen výzkumného týmu přitlačí sterilním gázovým obvazem, dokud krvácení nepřestane (nejméně 10 minut). Následně bude místo řezu uzavřeno pomocí motýlkových stehů (Steri-strips) a poté bude aplikován obvaz. Na obvaz bude aplikován elastický tlakový obvaz, aby se minimalizovala možnost vzniku modřin. Účastníkům pak bude řečeno, aby motýlkové stehy a tlakový obvaz nechali na ráně po dobu 96 a 24 hodin. Účastníkovi bude poskytnut "bioptický péčový kit" (popsaný v sekci 10.1/Bioptický péčový kit), aby mohl po opuštění laboratoře řez řádně ošetřit. Člen výzkumného týmu kontaktuje účastníky den po pokusu, aby zkontroloval proces hojení.

Odporové cvičení a příjem jídla: Ihned po uzavření druhé biopsie účastníci začnou s rozcvičkou na akutní dávku odporového cvičení. Pro začátek budou účastníci 5 minut šlapat na standardním cykloergometru vlastním tempem. Následně účastníci zahájí odporové cvičení. Účastníci dokončí rozcvičkovou sérii při ~60 % jejich deseti opakování maxima (10RM) změřeného při předběžném testování, následovanou 4 sériemi 10-12 opakování při ~90 % 10RM s 1-3 minutami odpočinku mezi sériemi pro předkopávání i leg press. Účastníci budou odpovídat zátěži, sériím a opakováním z prvního pokusu během druhého pokusu.

Ihned po dokončení cvičení se účastníci vrátí do infuzní místnosti ke konzumaci jídel. Během prvního pokusu budou účastníci randomizováni a vyváženi, aby během startované konstantní infuze pro měření metabolismu bílkovin konzumovali buď 1 střední brambor s kůží a kombinaci 2 uncí libového mletého hovězího (274 kcal, 19,3 g bílkovin, 5 g tuků, 37 g sacharidů a 4 g vlákniny), 2 plátky bílého chleba a hovězí kombinaci (262 kcal, 19,8 g bílkovin, 6,8 g tuků, 28 g sacharidů a 1,8 g vlákniny), nebo 2 unce hovězího (93% libové maso/7% tuk; 110 kcal, 14,8 g bílkovin a 5 g tuků). Během druhého pokusu budou účastníci náhodně přiřazeni ke konzumaci jedné ze zbývajících podmínek.

Komerčně dostupné brambory s kůží budou nakrájeny na 1palcové kostky a pečeny spolu s hovězím plátkem při 200°C přibližně 30 minut, nebo dokud vnitřní teplota hovězího nedosáhne 75°C těsně před konzumací v den pokusu. Jídlo bude uvařeno na vnitřní teplotu alespoň 165°F v souladu s minimální vnitřní teplotou USDA, aby se zabránilo onemocnění z potravin.