Sinergia Dietetica nella Sintesi Proteica Muscolare (POTATO)

1. Test preliminari

   1.1 Preparazioni: I partecipanti si presenteranno per la sessione di test preliminari dopo un digiuno notturno (~10 h senza cibi/bevande calorici consumati) e avendo evitato esercizio fisico per le 72 ore precedenti. Prima di qualsiasi procedura in presenza, i partecipanti saranno informati sulle procedure e sui rischi associati alla partecipazione tramite la revisione del documento di consenso informato. Ai partecipanti sarà incoraggiato a fare domande e ad avere risposte alle loro domande prima di essere chiesto se desiderano continuare. La conferma sarà documentata tramite firma su un modulo del processo di consenso informato.

   1.2 Antropometria: Dopo la fornitura del consenso, l'altezza e il peso dei partecipanti saranno misurati per confermare che l'indice di massa corporea (BMI) sia entro i limiti di idoneità (18,5 - 30 kg/m^2). Poiché i partecipanti sono già stati valutati per tutti gli altri criteri di inclusione ed esclusione, un BMI idoneo comporterà l'inclusione nello studio e la continuazione della sessione di test preliminari. Dopo la conferma dell'idoneità allo studio, la pressione sanguigna sarà misurata da un membro addestrato del team di ricerca. Successivamente, la composizione corporea sarà determinata tramite assorbimetria a raggi X a doppia energia (DEXA) in conformità con le raccomandazioni del produttore. In breve, ai partecipanti sarà chiesto di rimuovere tutti gli oggetti metallici dal proprio corpo prima di essere posizionati da un tecnico addestrato per una misurazione accurata della massa magra e della massa grassa. La scansione dura circa 6-10 minuti durante i quali al partecipante sarà istruito di rimanere immobile.

   1.3 Registro dietetico abituale: Le abitudini dietetiche attuali saranno valutate attraverso un sistema di registro dietetico online automatizzato autosomministrato (ASA24). I partecipanti riceveranno il proprio nome utente e password individuali durante questa sessione e sarà chiesto loro di registrare per 3 giorni consecutivi (2 giorni feriali e 1 giorno del fine settimana) prima di ogni prova. Poiché è online, i partecipanti possono completarlo fuori sede a loro piacimento.

   1.4 Tasso metabolico a riposo: Il tasso metabolico a riposo (RMR) sarà valutato tramite calorimetria indiretta. Questo è un test non faticoso in cui l'RMR viene misurato utilizzando un sistema di analisi dei gas automatizzato. Questo dispositivo misura il consumo di ossigeno e la produzione di anidride carbonica come differenza tra le concentrazioni di gas inspirato ed espirato. Prima dell'inizio del test, i partecipanti si sdraieranno supini su un tavolo e un cappuccio trasparente in plastica rigida e un drappeggio morbido in plastica trasparente saranno posizionati sul collo, testa e spalle dei partecipanti per catturare i gas espirati. I partecipanti poi rimarranno immobili senza addormentarsi mentre le concentrazioni di gas respiratori vengono catturate. Il test si concluderà quando l'RMR è stabile per almeno 20 minuti (tipicamente ~30 minuti dall'inizio).

   1.5 Test di dieci ripetizioni massime (10RM): Dopo il test del tasso metabolico a riposo, ai partecipanti sarà testato il loro 10RM per l'estensione delle gambe e la pressa per le gambe. Per iniziare, i partecipanti pedaleranno a un ritmo auto-selezionato su un cicloergometro standard per ~5 minuti. I partecipanti poi completeranno una serie di 8-10 ripetizioni a ~50% del loro 10RM previsto seguita da 1-2 minuti di riposo. Il carico sarà poi impostato a ~90% del loro 10RM previsto. Il carico sarà aumentato del 2,5-5,0% dopo ogni tentativo riuscito fino al fallimento (tipicamente entro 5 tentativi). Saranno concessi due minuti di riposo tra i tentativi massimali e 5 minuti tra gli esercizi. L'estensione delle gambe sarà testata prima seguita dalla pressa per le gambe. Prima di lasciare il laboratorio, ai partecipanti sarà permesso di fare qualsiasi domanda abbiano prima di concludere la sessione.

   1.6 Accelerometri: Prima di lasciare il laboratorio, ai partecipanti sarà dato un accelerometro (Actigraph) per valutare i livelli di attività fisica quotidiana (cioè conteggio dei passi). Il personale di ricerca dimostrerà l'uso corretto e istruirà i partecipanti a indossare il dispositivo per l'intera durata dello studio. Dopo la dimostrazione, ai partecipanti sarà ricordato di evitare qualsiasi esercizio estraneo e di indossare il dispositivo per due giorni prima delle prove.

   1.7 Pianificazione: Prima di lasciare il laboratorio, i partecipanti e il team di ricerca identificheranno una data per la prima prova di infusione (almeno 7 giorni dopo i test preliminari). Inoltre, il team di ricerca fornirà ai partecipanti un pasto standardizzato da consumare la sera prima della prima infusione e istruzioni per evitare esercizio fisico intenso e consumo di alcol per 72 e 24 ore prima della prima prova. Ai partecipanti sarà anche offerto uno spuntino prima di lasciare il laboratorio.

2. Prove di infusione

2.1 Preparazioni: Almeno 7 giorni dopo i test preliminari o l'infusione precedente, ai partecipanti sarà chiesto di tornare in laboratorio per una prova di infusione. La mattina di ogni infusione, i partecipanti arriveranno in laboratorio al mattino dopo un digiuno notturno (~10 h senza cibi/bevande calorici consumati) e avendo evitato esercizio fisico intenso e consumo di alcol per 72 e 24 ore, rispettivamente. Per 3 giorni precedenti ogni prova, ai partecipanti sarà chiesto di registrare le loro assunzioni dietetiche tramite un sistema di registro dietetico online automatizzato autosomministrato (24 ore) (ASA24).

2.2 Infusione di isotopi stabili: All'arrivo in laboratorio, i partecipanti si sdraieranno supini su un letto di tipo clinico prima di avere un catetere endovenoso posizionato in una vena dorsale della mano o del braccio. Non saranno fatti più di quattro tentativi per posizionare il catetere. Dopo il prelievo di sangue basale, una dose di attivazione di L-[1-13C] leucina e L-[anello 2H5] fenilalanina sarà somministrata prima dell'inizio di un'infusione costante utilizzando una pompa per infusione calibrata. I traccianti di aminoacidi isotopici stabili applicati in questo esperimento non sono radioattivi e sono completamente sicuri. Questi isotopi stabili arricchiranno il pool di aminoacidi nel corpo permettendoci di identificare il tasso di incorporazione degli aminoacidi nei tessuti. La preparazione dei traccianti per la somministrazione endovenosa avverrà in un ambiente sterile sotto una cappa a flusso laminare dedicata alla preparazione dei traccianti e in conformità con le linee guida delle Buone Pratiche di Fabbricazione.

2.3 Raccolta del sangue: Dopo che i ricercatori iniziano l'infusione, un secondo catetere sarà posizionato in una vena della mano o del braccio sull'altro lato in modo che i ricercatori possano raccogliere sangue durante la prova. Durante la prova, il sangue sarà raccolto periodicamente dal catetere. Prima della raccolta di alcuni campioni, una coperta riscaldante (60°C) sarà posizionata sul sito del catetere (braccio o mano) per "arterializzare" (imitare il sangue all'interno delle arterie) i campioni di sangue. Un totale di 17 campioni di sangue (~174 mL) sarà raccolto durante la prima prova, mentre nella seconda prova, 15 campioni di sangue (~149 mL) saranno raccolti. La raccolta regolare di sangue permette la determinazione dell'arricchimento isotopico, delle concentrazioni di aminoacidi e delle concentrazioni di acidi grassi liberi nel sangue. Tra i prelievi, il catetere sarà mantenuto pervio utilizzando un gocciolamento di soluzione salina allo 0,9% a bassa velocità.

2.4 VCO2: La produzione di anidride carbonica (VCO2) sarà determinata dall'aria espirata campionata da un boccaglio a circuito aperto attaccato a un tubo. Immediatamente dopo che l'analisi VCO2 è eseguita (10 minuti), ai partecipanti sarà chiesto di espirare in un boccaglio separato attaccato a un sacchetto di plastica. Questo campione di respiro è conservato in una provetta sterile per l'analisi futura dell'arricchimento del tracciante isotopico stabile nel respiro.

2.5 Raccolta del muscolo: Un totale di cinque biopsie muscolari saranno raccolte (tre come parte della 1a infusione e due durante la 2a infusione). La procedura di biopsia coinvolge la rimozione di un piccolo pezzo di tessuto muscolare utilizzando un ago cavo sterile (ago di Bergström) e sarà eseguita dal Dr. Nicholas Burd sotto gli auspici del Dr. Jared Willard, MD. I partecipanti riposeranno su un letto e l'area per la biopsia sarà rasata, se necessario. Successivamente, l'area sarà sterilizzata utilizzando gluconato di clorexidina al 4% prima che 5 mL di anestetico locale (Xilocaina al 2% con 1:100.000 epinefrina) siano iniettati sottocute con particolare cura per evitare di infiltrarsi nel muscolo. Una volta che l'anestetico è attivo (~10 min), il Dr. Burd farà una piccola incisione (~4-5 mm) nella pelle per creare un'apertura attraverso cui inserire l'ago per biopsia per la raccolta del tessuto. Il Dr. Burd taglierà rapidamente un piccolo pezzo di muscolo (~50-100 mg; circa le dimensioni di una gomma per matita standard) e rimuoverà l'ago dalla gamba del soggetto. Durante la raccolta del campione (~30 sec), i soggetti potrebbero sentire una sensazione di pressione profonda nella loro gamba. Un drappeggio sterile monouso sarà posizionato sotto la coscia del partecipante e guanti sterili saranno utilizzati per tutte le procedure di biopsia.

Dopo che la biopsia è completata, un membro addestrato del team di ricerca applicherà pressione con garza sterile finché il sanguinamento si ferma (almeno 10 min). Successivamente, il sito dell'incisione sarà chiuso utilizzando punti a farfalla (Steri-strips) seguiti dall'applicazione di una benda. Una fascia elastica di pressione sarà applicata sopra la benda per minimizzare la possibilità di lividi. Ai partecipanti sarà poi istruito di lasciare i punti a farfalla e la fascia di pressione sulla ferita per 96 e 24 ore, rispettivamente. Al partecipante sarà fornito un "kit di cura per biopsia" (descritto nella sezione 10.1/Kit di cura per biopsia) per prendersi adeguatamente cura dell'incisione dopo aver lasciato il laboratorio. Un membro del team di ricerca contatterà i partecipanti il giorno seguente la prova per controllare il processo di guarigione.

Esercizio di resistenza e ingestione del pasto: Immediatamente dopo la chiusura della seconda biopsia, i partecipanti inizieranno il riscaldamento per una sessione acuta di esercizio di resistenza. Per iniziare, i partecipanti pedaleranno a un ritmo auto-selezionato su un cicloergometro standard per 5 minuti. Successivamente, i partecipanti inizieranno l'esercizio di resistenza. I partecipanti completeranno una serie di riscaldamento a ~60% del loro dieci ripetizioni massime (10RM) misurato ai test preliminari seguita da 4 serie di 10-12 ripetizioni a ~90% 10RM con 1-3 minuti di riposo tra le serie sia per l'estensione delle gambe che per la pressa per le gambe. I partecipanti corrisponderanno il carico, le serie e le ripetizioni dalla prima prova durante la loro seconda prova.

Immediatamente dopo il completamento dell'esercizio, i partecipanti torneranno nella stanza di infusione per consumare i pasti. Durante la prima prova, i partecipanti saranno randomizzati e controbilanciati per ingerire o 1 patata russet media con buccia e combinazione di carne macinata magra equivalente a 2 once (274 kcal, 19,3 g proteine, 5 g grassi, 37 g carboidrati e 4 g fibre), 2 fette di pane bianco e combinazione di manzo (262 kcal, 19,8 g proteine, 6,8 g grassi, 28 g carboidrati e 1,8 g fibre), o manzo equivalente a 2 once (93% carne magra/7% grassi; 110 kcal, 14,8 g proteine e 5 g grassi) durante le infusioni costanti attivate per la misurazione del metabolismo proteico. Durante la seconda prova, i partecipanti saranno assegnati casualmente a consumare una delle condizioni rimanenti.

La patata russet disponibile commercialmente con buccia sarà tagliata in cubetti da 1 pollice e cotta insieme alla polpetta di carne macinata a 200°C per ~30 minuti, o finché la temperatura interna del manzo raggiunge 75°C subito prima del consumo il giorno della prova. Il pasto sarà cotto a una temperatura interna di almeno 165°F in conformità con la temperatura interna minima dell'USDA per prevenire malattie di origine alimentare.