Ruokavalion synergia lihasproteiinisynteesissä (POTATO)

1. Alustavat testit

   1.1 Valmistelut: Osallistujat saapuvat alustavaan testausistuntoon yön yli paastottuaan (~10 h ilman energiapitoisia ruokia/juomia) ja välttäneet liikuntaa 72 h aiemmin. Ennen mitään henkilökohtaisia toimenpiteitä osallistujille selostetaan osallistumiseen liittyvät menettelyt ja riskit tarkastelemalla tietoon perustuvan suostumuksen asiakirjaa. Osallistujia rohkaistaan esittämään kysymyksiä ja saamaan kysymyksiinsä vastaukset ennen kuin heiltä kysytään, haluavatko he jatkaa. Vahvistus dokumentoidaan allekirjoittamalla tietoon perustuvan suostumuksen prosessilomake.

   1.2 Antropometria: Suostumuksen antamisen jälkeen osallistujien pituus ja paino mitataan varmistaakseen, että painoindeksi (BMI) on kelpoisuusrajojen sisällä (18,5 - 30 kg/m^2). Koska osallistujat on jo arvioitu kaikille muille sisällytys- ja poissulkemiskriteereille, kelvollinen BMI johtaa tutkimukseen sisällyttämiseen ja alustavan testausistunnon jatkamiseen. Tutkimuskelpoisuuden vahvistamisen jälkeen verenpainetta mitataan koulutetun tutkimusryhmän jäsenen toimesta. Tämän jälkeen kehon koostumus määritetään kaksoisenergia-röntgenabsorptiometrialla (DEXA) valmistajan suositusten mukaisesti. Lyhyesti sanottuna osallistujia pyydetään poistamaan kaikki metalliesineet henkilöstään ennen kuin koulutettu teknikko asettaa heidät paikoilleen luotettavan lihasmassan ja rasvamassan mittauksen varmistamiseksi. Skannaus kestää noin 6-10 minuuttia, jonka aikana osallistujaa ohjeistetaan pysymään liikkumattomana.

   1.3 Tavanomainen ruokavaliotietue: Nykyisiä ruokatottumuksia arvioidaan verkkopohjaisen automatisoitun itsehallinnan (ASA24) ruokavaliotietuejärjestelmän avulla. Osallistujat saavat yksilöllisen käyttäjätunnuksensa ja salasanansa tämän istunnon aikana ja heitä pyydetään tallentamaan kolmena peräkkäisenä päivänä (2 arkipäivää ja 1 viikonloppupäivä) ennen jokaista koetta. Koska se on verkossa, osallistujat voivat suorittaa sen muualla vapaa-ajallaan.

   1.4 Lepometabolianopeus: Lepometabolianopeus (RMR) arvioidaan epäsuoralla kalorimetrialla. Tämä on ei-rasittava testi, jossa RMR mitataan automatisoitulla kaasuanalyysijärjestelmällä. Tämä laite mittaa hapenkulutusta ja hiilidioksidituotantoa hengitysilmassa olevien kaasupitoisuuksien erotuksena. Testin alkamista ennen osallistujat makaavat selällään pöydällä ja selkeä, kova muovihuppu ja pehmeä, kirkas muoviverho asetetaan osallistujien kaulan, pään ja olkapäiden ylle poistuvien kaasujen keräämiseksi. Osallistujat makaavat sitten liikkumattomina nukahtamatta, kun hengityskaasupitoisuuksia kerätään. Testaus päättyy, kun RMR on vakaa vähintään 20 minuutin ajan (tyypillisesti noin 30 minuuttia alusta).

   1.5 Kymmenen toiston maksimi (10RM) -testaus: Lepometabolianopeustestauksen jälkeen osallistujien 10RM testataan jalkojen ojennukselle ja jalkaprässille. Aluksi osallistujat pyöräilevät itsensä valitsemalla vauhdilla standardipyöräergometrillä noin 5 minuuttia. Osallistujat suorittavat sitten sarjan 8-10 toistoa noin 50 % heidän ennustetusta 10RM:stä, jota seuraa 1-2 minuutin lepo. Kuormitus asetetaan sitten noin 90 % heidän ennustetusta 10RM:stä. Kuormitusta lisätään 2,5-5,0 % jokaisen onnistuneen yrityksen jälkeen, kunnes epäonnistuminen tapahtuu (tyypillisesti 5 yrityksen sisällä). Maksimiyritysten välillä annetaan kaksi minuuttia lepoa ja 5 minuuttia liikkeiden välillä. Jalkojen ojennus testataan ensin, sitten jalkaprässi. Ennen laboratoriosta lähtemistä osallistujille annetaan mahdollisuus esittää kaikki kysymyksensä ennen istunnon päättymistä.

   1.6 Kiihtyvyysanturit: Ennen laboratoriosta lähtemistä osallistujille annetaan kiihtyvyysanturi (Actigraph) päivittäisen fyysisen aktiivisuuden (eli askelluksen) arvioimiseksi. Tutkimushenkilöstö esittelee oikean käytön ja ohjeistaa osallistujia käyttämään laitetta koko tutkimuksen ajan. Esittelyn jälkeen osallistujille muistutetaan välttämään kaikkea ylimääräistä liikuntaa ja käyttämään laitetta kaksi päivää ennen kokeita.

   1.7 Suunnittelu: Ennen laboratoriosta lähtemistä osallistujat ja tutkimusryhmä määrittävät päivämäärän ensimmäiselle infuusiotestille (vähintään 7 päivää alustavien testien jälkeen). Lisäksi tutkimusryhmä tarjoaa osallistujille standardoidun aterian nautittavaksi edellisenä iltana ennen ensimmäistä infuusiota ja ohjeet välttää rasittavaa liikuntaa ja alkoholin käyttöä 72 ja 24 tuntia ennen ensimmäistä koetta. Osallistujille tarjotaan myös välipala ennen laboratoriosta lähtemistä.

2. Infuusiotestit

2.1 Valmistelut: Vähintään 7 päivää alustavien testien tai edellisen infuusion jälkeen osallistujia pyydetään palaamaan laboratorioon infuusiotestiin. Jokaisen infuusion aamuna osallistujat saapuvat laboratorioon aamulla yön yli paastottuaan (~10 h ilman energiapitoisia ruokia/juomia) ja välttäneet rasittavaa liikuntaa ja alkoholin käyttöä 72 ja 24 tuntia, vastaavasti. Kolmena päivänä ennen jokaista koetta osallistujia pyydetään tallentamaan ruokavalionsa verkkopohjaisen automatisoitun itsehallinnan (24 tunnin) ruokavaliotietuejärjestelmän (ASA24) kautta.

2.2 Vakaa isotooppi-infuusio: Saavuttuaan laboratorioon osallistujat makaavat selällään kliinisellä sängyllä ennen kuin intravenoosinen katetri asetetaan käden tai käsivarren selkäpuoleiseen veeniin. Katetrin asettamiseen ei tehdä enempää kuin neljää yritystä. Perusverinäytteenoton jälkeen alkusääntö L-[1-13C] leusiinille ja L-[rengas 2H5] fenyylialaniinille annetaan ennen jatkuvan infuusion aloittamista kalibroidulla infuusiopumpulla. Tässä kokeessa käytetyt vakaat isotooppiaminohappomerkit eivät ole radioaktiivisia ja ovat täysin turvallisia. Nämä vakaat isotoopit rikastavat aminohappopoolia kehossa, mikä mahdollistaa aminohappojen sisällyttämisnopeuden tunnistamisen kudoksiin. Merkkien valmistelu intravenoosista antamista varten tapahtuu steriilissä ympäristössä laminaarivuokaapussa, joka on omistettu merkkien valmistukseen ja hyvien valmistuskäytäntöjen ohjeiden mukaisesti.

2.3 Verenkeräys: Kun tutkijat alkavat infuusion, toinen katetri asetetaan toisen puolen käden tai käsivarren veeniin, jotta tutkijat voivat kerätä verta koko kokeen ajan. Kokeen aikana verta kerätään ajoittain katetrista. Joidenkin näytteiden keräämistä ennen kuumapeitto (60°C) asetetaan katetrin kohdalle (käsivarsi tai käsi) "arterialisoimaan" (matkimaan valtimoissa olevaa verta) verinäytteet. Ensimmäisen kokeen aikana kerätään yhteensä 17 verinäytettä (~174 ml), kun taas toisessa kokeessa kerätään 15 verinäytettä (~149 ml). Veren säännöllinen keräys mahdollistaa isotooppisen rikastumisen, aminohappopitoisuuksien ja vapaan rasvahappopitoisuuksien määrittämisen veressä. Vedonlyöntien välillä katetria pidetään avoimena käyttämällä 0,9 % suolaliuosta matalalla nopeudella.

2.4 VCO2: Hiilidioksidituotanto (VCO2) määritetään uloshengitysilman perusteella, joka otetaan letkuun kiinnitetystä avoimen piirin suukappaleesta. Välittömästi VCO2-analyysin suorittamisen jälkeen (10 minuuttia) osallistujia pyydetään hengittämään erilliseen muovipussiin kiinnitettyyn suukappaleeseen. Tämä hengitysnäyte varastoidaan steriiliin vacutaineriin vakaiden isotooppimerkkien rikastumisen tulevaa analyysiä varten hengityksessä.

2.5 Lihaskeräys: Yhteensä viisi lihasbiopsiaa kerätään (kolme osana 1. infuusiota ja kaksi 2. infuusion aikana). Biopsiamenettelyssä poistetaan pieni lihaskudospalikka steriilillä ontolla neulalla (Bergströmin neula) ja sen suorittaa tohtori Nicholas Burd tohtori Jared Willardin, MD, alaisuudessa. Osallistujat lepäävät sängyllä ja biopsian alue ajetaan, jos tarvitaan. Tämän jälkeen alue steriloidaan käyttämällä 4 % klooriheksidiiniglukonaattia, ennen kuin 5 ml paikallispuudutusta (2 % ksylokaiinia 1:100 000 adrenaliinilla) ruiskutetaan ihonalaisesti erityisellä huolella välttääkseen lihaksen tunkeutumista. Kun puudutus on aktiivinen (~10 min), tohtori Burd tekee pienen leikkauksen (~4-5 mm) ihoon aukon luomiseksi, jonka kautta biopsianeula asetetaan kudoksen keräämiseksi. Tohtori Burd leikkaa nopeasti pienen lihaspalan (~50-100 mg; noin tavallisen kumin pyyhkimen kokoinen) ja poistaa neulan kohteen jalasta. Näytteen keräyksen aikana (~30 sek) kohteet saattavat tuntea syvän paineen tunteen jalassaan. Steriili kertakäyttöinen verho asetetaan osallistujan reiden alle ja steriilejä käsineitä käytetään kaikissa biopsiamenettelyissä.

Biopsian päätyttyä koulutettu tutkimusryhmän jäsen painaa steriiliä sideharsoa, kunnes verenvuoto pysähtyy (vähintään 10 min). Tämän jälkeen leikkauspaikka suljetaan käyttämällä perhosompeleita (Steri-strips) ja sitten laastaria. Kimmoisa paineside asetetaan laastarin päälle mustelmien mahdollisuuden minimoimiseksi. Osallistujia ohjeistetaan sitten jättämään perhosompeleet ja paineside haavalle 96 ja 24 tuntia, vastaavasti. Osallistujalle tarjotaan "biopsianhoitopaketti" (kuvattu kohdassa 10.1/Biopsianhoitopaketti) leikkauksen asianmukaista hoitoa varten laboratoriosta lähdön jälkeen. Tutkimusryhmän jäsen ottaa yhteyttä osallistujiin kokeen seuraavana päivänä tarkistaakseen paranemisprosessin.

Vastusliikunta ja aterian nauttiminen: Välittömästi toisen biopsian sulkemisen jälkeen osallistujat alkavat lämmittelyä akuuttia vastusliikuntasarjaa varten. Aluksi osallistujat pyöräilevät itsensä valitsemalla vauhdilla standardipyöräergometrillä 5 minuuttia. Tämän jälkeen osallistujat alkavat vastusliikuntaa. Osallistujat suorittavat lämmittelysarjan noin 60 % heidän kymmenen toiston maksimistaan (10RM), mitattuna alustavissa testeissä, ja sitten 4 sarjaa 10-12 toistoa noin 90 % 10RM:stä 1-3 minuutin levolla sarjojen välillä sekä jalkojen ojennukselle että jalkaprässille. Osallistujat vastaavat kuormitusta, sarjoja ja toistoja ensimmäisestä kokeesta toisen kokeensa aikana.

Välittömästi harjoituksen päätyttyä osallistujat palaavat infuusiohuoneeseen nauttimaan aterioita. Ensimmäisen kokeen aikana osallistujat randomisoidaan ja tasapainotetaan nauttimaan joko 1 keskikokoinen ruskea peruna kuorineen ja 2 unssia vastaava vähärasvainen jauheliha-yhdistelmä (274 kcal, 19,3 g proteiinia, 5 g rasvaa, 37 g hiilihydraatteja ja 4 g kuitua), 2 viipaleita valkoista leipää ja jauheliha-yhdistelmä (262 kcal, 19,8 g proteiinia, 6,8 g rasvaa, 28 g hiilihydraatteja ja 1,8 g kuitua) tai 2 unssia vastaavaa jauhelihaa (93 % rasvatonta lihaa/7 % rasvaa; 110 kcal, 14,8 g proteiinia ja 5 g rasvaa) alkusääntöisten jatkuvien infuusioiden aikana proteiiniaineenvaihdunnan mittaamiseksi. Toisen kokeen aikana osallistujat satunnaisesti määrätään nauttimaan yhden jäljellä olevista vaihtoehdoista.

Kaupallisesti saatavilla oleva ruskea peruna kuorineen leikataan 1 tuuman kuutioiksi ja paistetaan jauhelihapihvin kanssa 200°C:ssa noin 30 minuuttia, tai kunnes naudan sisälämpötila saavuttaa 75°C juuri ennen nauttimista kokeen päivänä. Ateria kypsennetään vähintään 165°F:n sisälämpötilaan USDA:n vähimmäissisälämpötilan mukaisesti ruokamyrkytysten estämiseksi.