Synergia Dietetyczna w Syntezie Białek Mięśniowych (POTATO)

1. Badania wstępne

   1.1 Przygotowania: Uczestnicy przybędą na sesję badań wstępnych po nocnym poście (~10 h bez spożywania kalorycznych pokarmów/napojów) i po powstrzymaniu się od ćwiczeń przez 72 godziny przed badaniem. Przed jakimikolwiek procedurami osobistymi uczestnicy zostaną poinformowani o procedurach i ryzykach związanych z uczestnictwem poprzez zapoznanie się z dokumentem świadomej zgody. Uczestnicy będą zachęcani do zadawania pytań i uzyskania na nie odpowiedzi przed zapytaniem, czy chcą kontynuować. Potwierdzenie zostanie udokumentowane poprzez podpis na formularzu procesu świadomej zgody.

   1.2 Antropometria: Po wyrażeniu zgody, wzrost i masa ciała uczestników zostaną zmierzone, aby potwierdzić, że wskaźnik masy ciała (BMI) mieści się w granicach kwalifikowalności (18,5 - 30 kg/m^2). Ponieważ uczestnicy zostali już ocenieni pod kątem wszystkich innych kryteriów włączenia i wykluczenia, kwalifikujący się BMI skutkować będzie włączeniem do badania i kontynuacją sesji badań wstępnych. Po potwierdzeniu kwalifikowalności do badania, ciśnienie krwi zostanie zmierzone przez przeszkolonego członka zespołu badawczego. Następnie skład ciała zostanie określony za pomocą absorpcjometrii rentgenowskiej podwójnej energii (DEXA) zgodnie z zaleceniami producenta. W skrócie, uczestnicy zostaną poproszeni o usunięcie wszystkich metalowych przedmiotów przed ułożeniem przez przeszkolonego technika w celu dokładnego pomiaru beztłuszczowej masy ciała i masy tłuszczowej. Skan trwa około 6-10 minut, podczas których uczestnik otrzyma instrukcję pozostania w bezruchu.

   1.3 Rejestr zwyczajowej diety: Aktualne nawyki żywieniowe zostaną ocenione za pomocą internetowego zautomatyzowanego systemu samodzielnie wypełnianego rejestru diety (ASA24). Uczestnicy otrzymają swoją indywidualną nazwę użytkownika i hasło podczas tej sesji i zostaną poproszeni o rejestrowanie przez 3 kolejne dni (2 dni powszednie i 1 dzień weekendowy) przed każdym badaniem. Ponieważ jest to online, uczestnicy mogą go wypełnić poza miejscem badania, według własnego uznania.

   1.4 Spoczynkowa przemiana materii: Spoczynkowa przemiana materii (RMR) zostanie oceniona za pomocą kalorymetrii pośredniej. Jest to test niewymagający wysiłku, w którym RMR jest mierzona za pomocą zautomatyzowanego systemu analizy gazów. Urządzenie to mierzy zużycie tlenu i produkcję dwutlenku węgla jako różnicę między stężeniami gazów wdychanych i wydychanych. Przed rozpoczęciem testu uczestnicy będą leżeć na plecach na stole, a przejrzysty, twardy plastikowy kaptur i miękka, przezroczysta plastikowa zasłona zostaną umieszczone na szyi, głowie i ramionach uczestnika, aby wychwycić wydychane gazy. Uczestnicy będą następnie leżeć nieruchomo, nie zasypiając, podczas gdy rejestrowane są stężenia gazów oddechowych. Test zakończy się, gdy RMR będzie stabilne przez co najmniej 20 min (zwykle ~30 min od początku).

   1.5 Test dziesięciopowtórzeniowego maksimum (10RM): Po teście spoczynkowej przemiany materii, uczestnicy będą mieli testowane 10RM dla wyprostu nóg i wyciskania nóg. Na początek uczestnicy będą pedałować we własnym tempie na standardowym ergometrze rowerowym przez ~5 minut. Następnie uczestnicy wykonają serię 8-10 powtórzeń przy ~50% ich przewidywanego 10RM, po której nastąpi 1-2 minuty odpoczynku. Obciążenie zostanie następnie ustawione na ~90% ich przewidywanego 10RM. Obciążenie będzie zwiększane o 2,5-5,0% po każdej udanej próbie aż do niepowodzenia (zwykle w ciągu 5 prób). Dwie minuty odpoczynku zostaną przydzielone między maksymalnymi próbami, a 5 minut między ćwiczeniami. Najpierw zostanie przetestowany wyprost nóg, a następnie wyciskanie nóg. Przed opuszczeniem laboratorium uczestnicy będą mogli zadać wszelkie pytania przed zakończeniem sesji.

   1.6 Akcelerometry: Przed opuszczeniem laboratorium uczestnicy otrzymają akcelerometr (Actigraph) do oceny poziomu codziennej aktywności fizycznej (tj. liczby kroków). Personel badawczy zademonstruje prawidłowe użycie i poinstruuje uczestników, aby nosili urządzenie przez cały czas trwania badania. Po demonstracji uczestnicy zostaną przypomnieni, aby powstrzymać się od jakiejkolwiek dodatkowej aktywności fizycznej i nosić urządzenie przez dwa dni poprzedzające badania.

   1.7 Planowanie: Przed opuszczeniem laboratorium uczestnicy i zespół badawczy ustalą datę pierwszego badania z wlewem (co najmniej 7 dni po badaniach wstępnych). Ponadto, zespół badawczy zapewni uczestnikom standaryzowany posiłek do spożycia w nocy przed pierwszym wlewem oraz instrukcje powstrzymania się od intensywnego wysiłku fizycznego i spożycia alkoholu przez 72 i 24 godziny przed pierwszym badaniem. Uczestnikom zostanie również zaoferowana przekąska przed opuszczeniem laboratorium.

2. Badania z wlewem

2.1 Przygotowania: Co najmniej 7 dni po badaniach wstępnych lub poprzednim wlewie, uczestnicy zostaną poproszeni o powrót do laboratorium na badanie z wlewem. W dniu każdego wlewu, uczestnicy przybędą do laboratorium rano po nocnym (~10 h bez kalorycznych pokarmów/napojów) poście i po powstrzymaniu się od intensywnego wysiłku fizycznego i spożycia alkoholu przez odpowiednio 72 i 24 godziny. Przez 3 dni poprzedzające każde badanie, uczestnicy zostaną poproszeni o rejestrowanie swojego spożycia pokarmów za pomocą internetowego zautomatyzowanego samodzielnie wypełnianego systemu rejestru diety (24-godzinnego) (ASA24).

2.2 Wlew stabilnych izotopów: Po przybyciu do laboratorium, uczestnicy będą leżeć na plecach na łóżku klinicznym przed założeniem dożylnego cewnika do żyły grzbietowej dłoni lub ramienia. Nie zostanie wykonanych więcej niż cztery próby założenia cewnika. Po pobraniu krwi na czczo, dawka inicjująca L-[1-13C] leucyny i L-[pierścień 2H5] fenyloalaniny zostanie podana przed rozpoczęciem stałego wlewu przy użyciu skalibrowanej pompy infuzyjnej. Stabilne izotopowe znaczniki aminokwasów stosowane w tym eksperymencie nie są radioaktywne i są całkowicie bezpieczne. Te stabilne izotopy wzbogacą pulę aminokwasów w organizmie, pozwalając nam określić tempo włączania aminokwasów do tkanek. Przygotowanie znaczników do podania dożylnego odbędzie się w sterylnym środowisku pod komorą laminarną przeznaczoną do przygotowywania znaczników i zgodnie z wytycznymi Dobrej Praktyki Wytwarzania.

2.3 Pobieranie krwi: Po tym, jak badacze rozpoczną wlew, drugi cewnik zostanie umieszczony w żyle dłoni lub ramienia po drugiej stronie, aby badacze mogli pobierać krew przez całe badanie. Podczas badania krew będzie okresowo pobierana z cewnika. Przed pobraniem niektórych próbek, podgrzewany koc (60°C) zostanie umieszczony na miejscu cewnika (ramię lub dłoń), aby „tętniczyć” (naśladować krew w tętnicach) próbki krwi. Łącznie 17 próbek krwi (~174 mL) zostanie pobranych podczas pierwszego badania, podczas gdy w drugim badaniu zostanie pobranych 15 próbek krwi (~149 mL). Regularne pobieranie krwi umożliwia określenie wzbogacenia izotopowego, stężeń aminokwasów i stężeń wolnych kwasów tłuszczowych we krwi. Między pobraniami cewnik będzie utrzymywany drożny przy użyciu kroplówki z 0,9% soli fizjologicznej z małą szybkością.

2.4 VCO2: Produkcja dwutlenku węgla (VCO2) zostanie określona z wydychanego powietrza pobranego przez otwarty ustnik podłączony do węża. Natychmiast po wykonaniu analizy VCO2 (10 minut), uczestnicy zostaną poproszeni o wydychanie powietrza do oddzielnego ustnika podłączonego do plastikowego worka. Ta próbka oddechu jest przechowywana w sterylnym probówce do przyszłej analizy wzbogacenia stabilnymi izotopami w oddechu.

2.5 Pobieranie mięśni: Łącznie zostanie pobranych pięć biopsji mięśni (trzy jako część 1. wlewu i dwie podczas 2. wlewu). Procedura biopsji polega na usunięciu małego fragmentu tkanki mięśniowej przy użyciu sterylnej pustej igły (igła Bergströma) i zostanie wykonana przez dr. Nicholasa Burda pod auspicjami dr. Jareda Willarda, MD. Uczestnicy będą odpoczywać na łóżku, a obszar do biopsji zostanie ogolony, jeśli będzie to wymagane. Następnie obszar zostanie wysterylizowany przy użyciu 4% glukonianu chlorheksydyny, zanim 5 mL środka znieczulającego miejscowo (2% Xylokaina z 1:100 000 adrenaliną) zostanie wstrzyknięte podskórnie ze szczególną ostrożnością, aby uniknąć infiltracji mięśnia. Gdy środek znieczulający zacznie działać (~10 min), dr Burd wykona małe nacięcie (~4-5 mm) w skórze, aby stworzyć otwór, przez który wprowadzi igłę biopsyjną do pobrania tkanki. Dr Burd szybko odetnie mały fragment mięśnia (~50-100 mg; o rozmiarze standardowej gumki do ołówka) i usunie igłę z nogi badanego. Podczas pobierania próbki (~30 sekund), badani mogą odczuwać uczucie głębokiego ucisku w nodze. Sterylna jednorazowa osłona zostanie umieszczona pod udem uczestnika, a sterylne rękawiczki zostaną użyte do wszystkich procedur biopsji.

Po zakończeniu biopsji, przeszkolony członek zespołu badawczego zastosuje ucisk sterylną gazą, aż krwawienie ustanie (co najmniej 10 min). Następnie miejsce nacięcia zostanie zamknięte przy użyciu plastrów motylkowych (Steri-strips), po czym zostanie nałożony opatrunek. Elastyczny opatrunek uciskowy zostanie nałożony na wierzch opatrunku, aby zminimalizować ryzyko siniaków. Uczestnicy otrzymają następnie instrukcję pozostawienia plastrów motylkowych i opatrunku uciskowego na ranie odpowiednio przez 96 i 24 godziny. Uczestnik otrzyma „zestaw do pielęgnacji biopsji” (opisany w rozdziale 10.1/Zestaw do pielęgnacji biopsji), aby właściwie zadbać o nacięcie po opuszczeniu laboratorium. Członek zespołu badawczego skontaktuje się z uczestnikami w dniu po badaniu, aby sprawdzić proces gojenia.

Ćwiczenia oporowe i spożycie posiłku: Natychmiast po zamknięciu drugiej biopsji, uczestnicy rozpoczną rozgrzewkę przed ostrym treningiem oporowym. Na początek uczestnicy będą pedałować we własnym tempie na standardowym ergometrze rowerowym przez 5 minut. Następnie uczestnicy rozpoczną ćwiczenia oporowe. Uczestnicy wykonają serię rozgrzewkową przy ~60% ich dziesięciopowtórzeniowego maksimum (10RM) zmierzonego podczas badań wstępnych, a następnie 4 serie po 10-12 powtórzeń przy ~90% 10RM z 1-3 minutami odpoczynku między seriami zarówno dla wyprostu nóg, jak i wyciskania nóg. Uczestnicy będą stosować takie samo obciążenie, liczbę serii i powtórzeń z pierwszego badania podczas swojego drugiego badania.

Natychmiast po zakończeniu ćwiczeń, uczestnicy wrócą do sali wlewów, aby spożyć posiłki. Podczas pierwszego badania, uczestnicy zostaną losowo przydzieleni i zrównoważeni, aby spożyć albo 1 średniego ziemniaka russet ze skórką i kombinację 2 uncji ekwiwalentu chudej mielonej wołowiny (274 kcal, 19,3 g białka, 5 g tłuszczu, 37 g węglowodanów i 4 g błonnika), 2 kromki białego chleba i kombinację wołowiny (262 kcal, 19,8 g białka, 6,8 g tłuszczu, 28 g węglowodanów i 1,8 g błonnika), albo 2 uncje ekwiwalentu wołowiny (93% chudego mięsa/7% tłuszczu; 110 kcal, 14,8 g białka i 5 g tłuszczu) podczas wlewów z dawką inicjującą i stałych do pomiaru metabolizmu białka. Podczas drugiego badania, uczestnicy zostaną losowo przydzieleni do spożycia jednego z pozostałych warunków.

Komercyjnie dostępny ziemniak russet ze skórką zostanie pokrojony w kostkę o boku 1 cala i upieczony razem z kotletem z mielonej wołowiny w temperaturze 200°C przez ~30 minut, lub do momentu, gdy wewnętrzna temperatura wołowiny osiągnie 75°C tuż przed spożyciem w dniu badania. Posiłek zostanie ugotowany do wewnętrznej temperatury co najmniej 165°F zgodnie z minimalną wewnętrzną temperaturą USDA, aby zapobiec chorobom przenoszonym przez żywność.