Implementering af molekylære diagnostiske veje

1. INTRODUKTION

For nogle neurologiske og neurodegenerative sygdomme er genetisk arv veldokumenteret, og retningslinjerne er blevet forbedret for at sikre en kvalitetsdiagnostisk tilgang. Desværre er dette scenarie ikke reproducerbart for de fleste af de neurologiske og neurodegenerative lidelser, også når en stærk genetisk komponent er dokumenteret. Dette skyldes:

• Polygenicitet, hvor forskellige gener kan bidrage til den samme fænotype (f.eks. Spastisk Paraplegi, forbundet med over 50 gener)
• Multifaktorielle sygdomme, genetisk kan forklarer kun en del af sygdommens ætiologi (såsom Parkinsons sygdom, hvor de identificerede gener kun er ansvarlige for 15% af patienterne med en klinisk diagnose)
• Lidelser med veletableret genetisk komponent, men de ansvarlige gener er ikke blevet identificeret.

Derfor er det nogle gange umuligt eller usandsynligt at fuldføre en molekylær diagnose for patienter med en klassisk eller kompleks fænotyper Nye teknologier såsom Next Generation Sequencing (NGS), tillader analyse af hundredvis af gener i et enkelt eksperiment. Implementeringen af ​​disse teknologier vil hjælpe med at identificere nye gener og nye varianter associerer

2. DESIGNSTUDIE

Målet med denne undersøgelse er at forbedre den diagnostiske tilgang inden for molekylær genetik gennem NGS. Dette vil gøre det muligt at karakterisere genomiske variationer og nye gener, der er ansvarlige for neurologiske og neurodegenerative sygdomme. NGS vil især identificere:

1. Nye gener forbundet med sygdomme karakteriseret ved genetisk heterogenitet, mendelsk og polygen arv.

2. Nye variationer, der er ansvarlige for sygdom, eller som kan øge den genetiske modtagelighed.

3. EKSPERIMENTEL FASE (bilag 1)

1. Neurologi og om nødvendigt genetisk rådgivning.
2. Genetisk rådgivning identificerer den molekylære analyse for en specifik patient. En blodprøve på 6 milliliter vil blive udtaget efter informeret samtykke (informeret samtykke Neuromed version 2.12.2015).
3. Specifikke retningslinjer for hver test vil blive fulgt for den første diagnostiske tilgang. Molekylær analyser udføres på Institut for Molekylær Genetik Center IRCCS INM Neuromed ved hjælp af Sanger-sekventering, multiplex ligationsafhængig probeamplifikation (MLPA) og mikrosatellitter.
4. Hvis den specifikke analyse ikke vil påvise mutationerne, vil NGS-panel bestående af 4.813 gener associeret med kendte kliniske fænotyper (klinisk exome eller Mendeliome) blive anvendt.

4. MATERIALER OG METODER

• DNA/RNA EKSTRAKTION Genomisk DNA vil blive isoleret fra perifere blodleukocytter i henhold til standardprocedurer. Total RNA vil blive isoleret fra dyrkede celler ved hjælp af TRIzol Reagent (Invitrogen, Life Technologies) i henhold til producentens instruktioner. Koncentrationen og renheden af ​​DNA/RNA-prøver vil blive bestemt ved hjælp af Nanodrop 2000 (Thermo Scientific, Life Technologies).
• MLPA (Multiplex ligation-dependent probe amplification) MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) er en multipleks PCR-metode, der påviser unormale kopiantal på op til 50 forskellige genomiske DNA- eller RNA-sekvenser, som er i stand til at skelne sekvenser, der kun adskiller sig i ét nukleotid.

Typisk for MLPA er, at det ikke er målsekvenser, der amplificeres, men MLPA-prober, der hybridiserer til målsekvensen. I modsætning til en standard multiplex PCR anvendes et enkelt par PCR-primere til MLPA-amplifikation. De resulterende amplifikationsprodukter af et SALSA MLPA-kits varierer mellem 130 og 480 nt i længden og kan analyseres ved kapillærelektroforese. Sammenligning af det opnåede topmønster med det for referenceprøver indikerer, hvilke sekvenser der viser afvigende kopital.

MLPA-reaktionen kan opdeles i fem hovedtrin: 1) DNA-denaturering og hybridisering af MLPA-prober; 2) ligeringsreaktion; 3) PCR-reaktion; 4) adskillelse af amplifikationsprodukter ved elektroforese; og 5) dataanalyse

• SEKVENSERING

DNA-prøven, der skal sekventeres, kombineres i et rør med primer, DNA-polymerase og DNA-nukleotider (dATP, dTTP, dGTP og dCTP). De fire farvestof-mærkede, kædeterminerende dideoxynukleotider tilsættes også, men i meget mindre mængder end de almindelige nukleotider.

Blandingen opvarmes først for at denaturere template-DNA'et (adskil strengene), og afkøles derefter, så primeren kan binde til den enkeltstrengede template. Når først primeren er bundet, hæves temperaturen igen, hvilket tillader DNA-polymerase at syntetisere nyt DNA fra primeren. DNA-polymerase vil fortsætte med at tilføje nukleotider til kæden, indtil det tilfældigvis tilføjer et dideoxynukleotid i stedet for et normalt. På det tidspunkt kan der ikke tilføjes yderligere nukleotider, så strengen ender med dideoxynukleotidet.

Denne proces gentages i et antal cyklusser. På det tidspunkt, hvor cyklussen er færdig, er det praktisk talt garanteret, at et dideoxynukleotid vil være blevet inkorporeret på hver enkelt position af mål-DNA'et i mindst én reaktion. Det vil sige, at røret vil indeholde fragmenter af forskellig længde, der ender ved hver af nukleotidpositionerne i det originale DNA (se figuren nedenfor). Enderne af fragmenterne vil blive mærket med farvestoffer, der indikerer deres endelige nukleotid. Efter reaktionen er udført, køres fragmenterne gennem et langt, tyndt rør indeholdende en gelmatrix i en proces kaldet kapillær gelelektroforese. Korte fragmenter bevæger sig hurtigt gennem porerne i gelen, mens lange fragmenter bevæger sig langsommere. Når hvert fragment krydser "mållinjen" for enden af ​​røret, belyses det af en laser, så det vedhæftede farvestof kan detekteres.

Det mindste fragment (der slutter kun ét nukleotid efter primeren) krydser mållinjen først, efterfulgt af det næstmindste fragment (der slutter to nukleotider efter primeren) og så videre. Således kan sekvensen af ​​det oprindelige stykke DNA opbygges et nukleotid ad gangen ud fra farverne af farvestoffer, der er registreret efter hinanden på detektoren. Dataene registreret af detektoren består af en række toppe i fluorescensintensitet, som vist i kromatogrammet ovenfor. DNA-sekvensen aflæses fra toppene i kromatogrammet.

• MICROSATELLIT Mikrosatellitanalyse inkluderer PCR-amplifikation af mikrosatellit-loci ved hjælp af fluorescensmærkede primere (6-FAM, TET, HEX, NED); mærkede PCR-produkter analyseres derefter ved kapillærelektroforese (ABI PRISM 310 og 3130 XL Applied Biosystem) (CE) eller elektroforese for at adskille allelerne efter størrelse.

Resultaterne blev behandlet ved hjælp af programmerne GENESCAN og GENOTYPER5. Når først værdierne af individuelle alleler var fastlagt, blev de tildelt hvert individ.

• NEXT GENERATION SEQUENCING (NGS)

I princippet ligner konceptet bag NGS-teknologien CE-sekventering-DNA-polymerase katalyserer inkorporeringen af ​​fluorescensmærkede deoxyribonukleotidtriphosphater (dNTP'er) i en DNA-skabelonstreng under sekventielle cyklusser af DNA-syntese. Under hver cyklus, ved inkorporeringspunktet, identificeres nukleotiderne ved fluorophorexcitation. Den kritiske forskel er, at i stedet for at sekventere et enkelt DNA-fragment, udvider NGS denne proces på tværs af millioner af fragmenter på en massivt parallel måde. Illumina-sekventering ved syntese (SBS) kemi er den mest udbredte kemi i branchen og leverer den højeste nøjagtighed, det højeste udbytte af fejlfri aflæsninger og den højeste procentdel af basiskald over Q30.6-8 Illumina NGS-arbejdsgangene omfatter 4 grundlæggende trin (figur 3):

o Biblioteksforberedelse-Sekventeringsbiblioteket er forberedt ved tilfældig fragmentering af DNA- eller cDNA-prøven efterfulgt af 5'- og 3'-adapterligering. Alternativt kombinerer "tagmentering" fragmenterings- og ligeringsreaktionerne i et enkelt trin, der i høj grad øger effektiviteten af ​​bibliotekets forberedelsesprocessen.9 Adapter-ligerede fragmenter PCR-amplificeres og geloprenses.

o Klyngegenerering - Til klyngegenerering indlæses biblioteket i en flowcelle, hvor fragmenter fanges på en græsplæne af overfladebundne oligoer, der er komplementære til biblioteksadapterne. Hvert fragment amplificeres derefter til distinkte, klonale klynger gennem broamplifikation. Når klyngegenerering er færdig, er skabelonerne klar til sekventering.

o Sequencing-Illumina-teknologien anvender en proprietær reversibel terminatorbaseret metode, der detekterer enkeltbaser, når de inkorporeres i DNA-templatestrenge. Da alle 4 reversible terminator-bundne dNTP'er er til stede under hver sekventeringscyklus, minimerer naturlig konkurrence inkorporeringsbias og reducerer i høj grad rå fejlrate sammenlignet med andre teknologier.6, 7 Resultatet er meget nøjagtig base-for-base-sekventering, der praktisk talt eliminerer sekvens-kontekst-specifikke fejl, selv inden for gentagne sekvensområder og homopolymerer.

o Dataanalyse-Under dataanalyse og justering justeres de nyligt identificerede sekvensaflæsninger derefter til et referencegenom. Efter justering er mange variationer af analyse mulige, såsom enkelt nukleotidpolymorfi (SNP) eller insertion-deletion (indel) identifikation, læsetælling for RNA-metoder, fylogenetisk eller metagenomisk analyse og mere.

5. STATISTIK

For at bestemme patogeniciteten af ​​varianterne vil vi blive udført:

• Molekylær test i probands familie.
• In-silico analyse af bioinformatik software (Sift: http://sift.jcvi.org/; PolyPhen: http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/).

• Frekvensanalyse i den generelle befolkning med SNP'er Banker (dbSNP: https: //www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/; EXAC: http://exac.broadinstitute.org/)

  6. ETISKE ASPEKTER Denne undersøgelse følger de etiske standarder i Helsinki-erklæringen og dens revisioner. Undersøgelsen vil blive gennemført under hensyntagen til de lovgivningsmæssige krav og overholdelse af lovgivningen. Det informerede samtykke allerede tidligere godkendt af den etiske komité.