Implementacja Molekularnych Ścieżek Diagnostycznych

1. WSTĘP

W przypadku niektórych chorób neurologicznych i neurodegeneracyjnych dziedziczenie genetyczne jest dobrze udokumentowane, a wytyczne zostały ulepszone, aby zapewnić wysokiej jakości podejście diagnostyczne. Niestety, ten scenariusz nie jest powtarzalny dla większości zaburzeń neurologicznych i neurodegeneracyjnych, także wtedy, gdy udokumentowany jest silny komponent genetyczny. Jest to spowodowane:

• Poligeniczność, w której różne geny mogą przyczyniać się do tego samego fenotypu (np. Paraplegia spastyczna, związana z ponad 50 genami)
• Choroby wieloczynnikowe, genetyczne mogą wyjaśniać tylko część etiologii choroby (np. choroba Parkinsona, w której zidentyfikowane geny odpowiadają tylko za 15% pacjentów z rozpoznaniem klinicznym)
• Zaburzenia z dobrze ugruntowanym komponentem genetycznym, ale odpowiedzialne geny nie zostały zidentyfikowane.

Dlatego czasami niemożliwe lub mało prawdopodobne jest postawienie diagnozy molekularnej u pacjentów z klasycznym lub złożonym fenotypem. Nowe technologie, takie jak sekwencjonowanie nowej generacji (NGS), pozwalają na analizę setek genów w jednym eksperymencie. Wdrożenie tych technologii pomoże zidentyfikować nowe geny i skojarzyć nowe warianty

2. STUDIUM PROJEKTOWE

Celem tego badania jest poprawa podejścia diagnostycznego w genetyce molekularnej poprzez NGS. Pozwoli to scharakteryzować wariacje genomowe i nowe geny odpowiedzialne za choroby neurologiczne i neurodegeneracyjne. W szczególności NGS określi:

1. Nowe geny związane z chorobami charakteryzującymi się heterogenicznością genetyczną, dziedzicznością mendlowską i poligeniczną.

2. Nowe odmiany odpowiedzialne za choroby lub mogące zwiększać podatność genetyczną.

3. FAZA EKSPERYMENTALNA (Załącznik 1)

1. Neurologia i, jeśli to konieczne, poradnictwo genetyczne.
2. Poradnia genetyczna identyfikuje analizę molekularną dla konkretnego pacjenta. Próbka krwi o objętości 6 mililitrów zostanie pobrana po uzyskaniu świadomej zgody (świadoma zgoda Neuromed wersja 2.12.2015).
3. Podczas pierwszego podejścia diagnostycznego będą przestrzegane szczegółowe wytyczne dla każdego testu. Analizy molekularne prowadzone są w Centrum Genetyki Molekularnej IRCCS INM Neuromed przy użyciu sekwencjonowania Sangera, multipleksowej amplifikacji sondy zależnej od ligacji (MLPA) oraz mikrosatelitów.
4. Jeśli specyficzna analiza nie wykryje mutacji, zastosowany zostanie panel NGS składający się z 4813 genów związanych ze znanymi fenotypami klinicznymi (egzom kliniczny lub mendeliom).

4. MATERIAŁY I METODY

• EKSTRAKCJA DNA/RNA Genomowy DNA zostanie wyizolowany z leukocytów krwi obwodowej zgodnie ze standardowymi procedurami. Całkowity RNA zostanie wyizolowany z hodowanych komórek przy użyciu odczynnika TRIzol (Invitrogen, Life Technologies) zgodnie z instrukcjami producenta. Stężenie i czystość próbek DNA/RNA zostaną określone za pomocą Nanodrop 2000 (Thermo Scientific, Life Technologies).
• MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) to multipleksowa metoda PCR wykrywająca nieprawidłową liczbę kopii do 50 różnych sekwencji genomowego DNA lub RNA, która jest w stanie rozróżnić sekwencje różniące się tylko jednym nukleotydem.

Typowe dla MLPA jest to, że to nie sekwencje docelowe są amplifikowane, ale sondy MLPA hybrydyzują z sekwencją docelową. W przeciwieństwie do standardowego multipleksowego PCR, do amplifikacji MLPA używana jest pojedyncza para starterów PCR. Otrzymane produkty amplifikacji zestawów SALSA MLPA mają długość od 130 do 480 nt i mogą być analizowane za pomocą elektroforezy kapilarnej. Porównanie otrzymanego wzoru pików z wzorcem próbek referencyjnych wskazuje, które sekwencje wykazują nieprawidłową liczbę kopii.

Reakcję MLPA można podzielić na pięć głównych etapów: 1) denaturacja DNA i hybrydyzacja sond MLPA; 2) reakcja ligacji; 3) reakcja PCR; 4) rozdział produktów amplifikacji metodą elektroforezy; oraz 5) analiza danych

• SEKWENCJA

Próbkę DNA do sekwencjonowania łączy się w probówce ze starterem, polimerazą DNA i nukleotydami DNA (dATP, dTTP, dGTP i dCTP). Dodaje się również cztery znakowane barwnikiem, kończące łańcuch nukleotydy dideoksy, ale w znacznie mniejszych ilościach niż zwykłe nukleotydy.

Mieszaninę najpierw ogrzewa się w celu denaturacji DNA matrycy (oddziela nici), a następnie schładza, aby starter mógł związać się z jednoniciową matrycą. Po związaniu startera temperatura jest ponownie podnoszona, umożliwiając polimerazie DNA syntezę nowego DNA, zaczynając od startera. Polimeraza DNA będzie kontynuować dodawanie nukleotydów do łańcucha, dopóki nie doda dideoksynukleotydu zamiast normalnego. W tym momencie nie można dodać dalszych nukleotydów, więc nić zakończy się dideoksynukleotydem.

Proces ten powtarza się w kilku cyklach. Do czasu zakończenia cykli jest praktycznie gwarantowane, że dideoksynukleotyd zostanie włączony w każdej pojedynczej pozycji docelowego DNA w co najmniej jednej reakcji. Oznacza to, że probówka będzie zawierać fragmenty o różnej długości, kończące się na każdej pozycji nukleotydowej w oryginalnym DNA (patrz rysunek poniżej). Końce fragmentów zostaną oznaczone barwnikami wskazującymi ich ostateczny nukleotyd. Po zakończeniu reakcji fragmenty przepuszcza się przez długą, cienką rurkę zawierającą matrycę żelową w procesie zwanym kapilarną elektroforezą żelową. Krótkie fragmenty poruszają się szybko przez pory żelu, podczas gdy długie fragmenty poruszają się wolniej. Gdy każdy fragment przekracza „linię mety” na końcu tuby, jest oświetlany laserem, co umożliwia wykrycie dołączonego barwnika.

Najmniejszy fragment (kończący się tylko o jeden nukleotyd za starterem) jako pierwszy przekracza linię mety, a następnie następny najmniejszy fragment (kończący się o dwa nukleotydy za starterem) i tak dalej. W ten sposób z kolorów barwników zarejestrowanych jeden po drugim na detektorze można zbudować sekwencję oryginalnego fragmentu DNA po jednym nukleotydzie na raz. Dane zarejestrowane przez detektor składają się z serii pików intensywności fluorescencji, jak pokazano na powyższym chromatogramie. Sekwencję DNA odczytuje się z pików na chromatogramie.

• MIKROSATELITA Analiza mikrosatelitarna obejmuje amplifikację PCR loci mikrosatelitarnych przy użyciu starterów znakowanych fluorescencyjnie (6-FAM, TET, HEX, NED); znakowane produkty PCR są następnie analizowane za pomocą elektroforezy kapilarnej (ABI PRISM 310 i 3130 XL Applied Biosystem) (CE) lub elektroforezy w celu rozdzielenia alleli według wielkości.

Wyniki opracowano przy użyciu programów GENESCAN i GENOTYPER5. Po ustaleniu wartości poszczególnych alleli przypisywano je każdemu osobnikowi.

• SEKWENCJONOWANIE NASTĘPNEJ GENERACJI (NGS)

Zasadniczo koncepcja technologii NGS jest podobna do technologii sekwencjonowania CE – polimeraza DNA katalizuje włączanie fluorescencyjnie znakowanych trifosforanów dezoksyrybonukleotydów (dNTP) do nici matrycy DNA podczas kolejnych cykli syntezy DNA. Podczas każdego cyklu, w miejscu włączenia, nukleotydy są identyfikowane przez wzbudzenie fluoroforem. Krytyczna różnica polega na tym, że zamiast sekwencjonowania pojedynczego fragmentu DNA, NGS rozszerza ten proces na miliony fragmentów w masowo równoległy sposób. Chemia sekwencjonowania Illumina przez syntezę (SBS) jest najczęściej stosowaną chemią w branży i zapewnia najwyższą dokładność, najwyższą wydajność bezbłędnych odczytów i najwyższy procent wywołań podstawowych powyżej Q30.6-8 Przepływy pracy Illumina NGS obejmują 4 podstawowe kroki (Rysunek 3):

o Przygotowanie biblioteki - Biblioteka do sekwencjonowania jest przygotowywana przez losową fragmentację próbki DNA lub cDNA, a następnie ligację adaptera 5' i 3'. Alternatywnie „znakowanie” łączy reakcje fragmentacji i ligacji w jednym etapie, co znacznie zwiększa wydajność procesu przygotowania biblioteki.9 Fragmenty zligowane z adapterami następnie amplifikuje się metodą PCR i oczyszcza na żelu.

o Generowanie klastrów — w przypadku generowania klastrów biblioteka jest ładowana do celi przepływowej, w której fragmenty są wychwytywane na trawniku oligo związanych z powierzchnią, komplementarnych do adapterów biblioteki. Każdy fragment jest następnie amplifikowany do odrębnych klastrów klonalnych poprzez amplifikację mostkową. Po zakończeniu generowania klastra szablony są gotowe do sekwencjonowania.

o Technologia Sequencing-Illumina wykorzystuje zastrzeżoną metodę opartą na odwracalnym terminatorze, która wykrywa pojedyncze zasady, gdy są one włączane do nici matrycy DNA. Ponieważ wszystkie 4 odwracalne dNTP związane z terminatorem są obecne podczas każdego cyklu sekwencjonowania, naturalna konkurencja minimalizuje błąd włączania i znacznie zmniejsza surowe wskaźniki błędów w porównaniu z innymi technologiami.6, 7 Rezultatem jest bardzo dokładne sekwencjonowanie zasada po zasadzie, które praktycznie eliminuje błędy związane z kontekstem sekwencji, nawet w obrębie powtarzalnych regionów sekwencji i homopolimerów.

o Analiza danych — podczas analizy i dopasowywania danych nowo zidentyfikowane odczyty sekwencji są następnie dopasowywane do genomu referencyjnego. Po dopasowaniu możliwych jest wiele wariantów analizy, takich jak polimorfizm pojedynczego nukleotydu (SNP) lub identyfikacja insercji-delecji (indel), zliczanie odczytów dla metod RNA, analiza filogenetyczna lub metagenomiczna i inne.

5. STATYSTYKA

W celu określenia patogeniczności wariantów wykonamy:

• Test molekularny w rodzinie probanda.
• Analiza in silico za pomocą oprogramowania bioinformatycznego (Sift: http://sift.jcvi.org/; PolyPhen: http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/).

• Analiza częstości w populacji ogólnej z bankami SNP (dbSNP: https: //www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/; EXAC: http://exac.broadinstitute.org/)

  6. ASPEKTY ETYCZNE Niniejsze badanie jest zgodne ze standardami etycznymi Deklaracji Helsińskiej i jej rewizji. Badanie zostanie przeprowadzone z uwzględnieniem wymogów regulacyjnych i zgodności z prawem. Świadoma zgoda została już wcześniej zatwierdzona przez komisję etyczną.