Implementierung molekulardiagnostischer Pathways

1. EINLEITUNG

Bei einigen neurologischen und neurodegenerativen Erkrankungen ist die genetische Vererbung gut dokumentiert, und die Richtlinien wurden verbessert, um einen qualitativ hochwertigen diagnostischen Ansatz zu gewährleisten. Leider ist dieses Szenario für die meisten neurologischen und neurodegenerativen Erkrankungen nicht reproduzierbar, auch wenn eine starke genetische Komponente dokumentiert ist. Das ist wegen:

• Polygenität, bei der verschiedene Gene zum selben Phänotyp beitragen können (z. B. Spastische Paraplegie, assoziiert mit über 50 Genen)
• Multifaktorielle Erkrankungen, genetisch kann nur einen Teil der Ätiologie der Erkrankung erklären (z. B. Morbus Parkinson, bei dem die identifizierten Gene nur für 15 % der Patienten mit klinischer Diagnose verantwortlich sind)
• Erkrankungen mit gut etablierter genetischer Komponente, aber die verantwortlichen Gene wurden nicht identifiziert.

Daher ist es manchmal unmöglich oder unwahrscheinlich, eine molekulare Diagnose für Patienten mit klassischen oder komplexen Phänotypen abzuschließen. Neue Technologien wie Next Generation Sequencing (NGS) ermöglichen die Analyse von Hunderten von Genen in einem einzigen Experiment. Die Implementierung dieser Technologien wird dazu beitragen, neue Gene zu identifizieren und neue Varianten zu assoziieren

2. DESIGNSTUDIE

Das Ziel dieser Studie ist es, den diagnostischen Ansatz in der Molekulargenetik durch NGS zu verbessern. Dies wird es ermöglichen, genomische Variationen und neue Gene zu charakterisieren, die für neurologische und neurodegenerative Erkrankungen verantwortlich sind. NGS identifiziert insbesondere:

1. Neue Gene im Zusammenhang mit Krankheiten, die durch genetische Heterogenität, Mendelsche und polygene Vererbung gekennzeichnet sind.

2. Neue Variationen, die für Krankheiten verantwortlich sind oder die genetische Anfälligkeit erhöhen können.

3. EXPERIMENTELLE PHASE (Anlage 1)

1. Neurologie und ggf. genetische Beratung.
2. Genetische Beratung identifiziert die molekulare Analyse für einen bestimmten Patienten. Nach Aufklärung wird eine Blutprobe von 6 Millilitern entnommen (Einwilligung Neuromed Version 2.12.2015).
3. Für den ersten diagnostischen Ansatz werden spezifische Richtlinien für jeden Test befolgt. Molekulare Analysen werden am Institut für Molekulargenetik des Zentrums IRCCS INM Neuromed mittels Sanger-Sequenzierung, Multiplex-Ligations-abhängiger Sondenamplifikation (MLPA) und Mikrosatelliten durchgeführt.
4. Wenn die spezifische Analyse die Mutationen nicht erkennt, wird ein NGS-Panel angewendet, das aus 4.813 Genen besteht, die mit bekannten klinischen Phänotypen (klinisches Exom oder Mendeliom) assoziiert sind.

4. MATERIALIEN UND METHODEN

• DNA/RNA-EXTRAKTION Genomische DNA wird gemäß Standardverfahren aus peripheren Blutleukozyten isoliert. Gesamt-RNA wird aus kultivierten Zellen unter Verwendung von TRIzol-Reagenz (Invitrogen, Life Technologies) gemäß den Anweisungen des Herstellers isoliert. Die Konzentration und Reinheit von DNA/RNA-Proben wird mit Nanodrop 2000 (Thermo Scientific, Life Technologies) bestimmt.
• MLPA (Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification) MLPA (Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification) ist eine Multiplex-PCR-Methode zum Nachweis anormaler Kopienzahlen von bis zu 50 verschiedenen genomischen DNA- oder RNA-Sequenzen, die in der Lage ist, Sequenzen zu unterscheiden, die sich nur in einem Nukleotid unterscheiden.

Typisch für MLPA ist, dass nicht Zielsequenzen amplifiziert werden, sondern MLPA-Sonden, die an die Zielsequenz hybridisieren. Im Gegensatz zu einer Standard-Multiplex-PCR wird für die MLPA-Amplifikation ein einziges Paar PCR-Primer verwendet. Die resultierenden Amplifikationsprodukte eines SALSA MLPA-Kits haben eine Länge zwischen 130 und 480 nt und können durch Kapillarelektrophorese analysiert werden. Ein Vergleich des erhaltenen Peakmusters mit dem von Referenzproben zeigt an, welche Sequenzen abweichende Kopienzahlen aufweisen.

Die MLPA-Reaktion kann in fünf Hauptschritte unterteilt werden: 1) DNA-Denaturierung und Hybridisierung von MLPA-Sonden; 2) Ligationsreaktion; 3) PCR-Reaktion; 4) Trennung von Amplifikationsprodukten durch Elektrophorese; und 5) Datenanalyse

• SEQUENZIERUNG

Die zu sequenzierende DNA-Probe wird in einem Röhrchen mit Primer, DNA-Polymerase und DNA-Nukleotiden (dATP, dTTP, dGTP und dCTP) kombiniert. Die vier farbstoffmarkierten, kettenterminierenden Didesoxynukleotide werden ebenfalls hinzugefügt, jedoch in viel geringeren Mengen als die gewöhnlichen Nukleotide.

Die Mischung wird zuerst erhitzt, um die Matrizen-DNA zu denaturieren (die Stränge zu trennen), dann abgekühlt, damit der Primer an die einzelsträngige Matrize binden kann. Sobald der Primer gebunden ist, wird die Temperatur wieder erhöht, wodurch die DNA-Polymerase ausgehend vom Primer neue DNA synthetisieren kann. Die DNA-Polymerase fügt der Kette weiterhin Nukleotide hinzu, bis sie statt eines normalen Nukleotids ein Didesoxy-Nukleotid hinzufügt. An diesem Punkt können keine weiteren Nukleotide hinzugefügt werden, sodass der Strang mit dem Didesoxy-Nukleotid endet.

Dieser Vorgang wird in mehreren Zyklen wiederholt. Wenn der Zyklus abgeschlossen ist, ist es praktisch garantiert, dass an jeder einzelnen Position der Ziel-DNA in mindestens einer Reaktion ein Didesoxynukleotid eingebaut wurde. Das heißt, das Röhrchen enthält Fragmente unterschiedlicher Länge, die an jeder der Nukleotidpositionen in der ursprünglichen DNA enden (siehe Abbildung unten). Die Enden der Fragmente werden mit Farbstoffen markiert, die ihr endgültiges Nukleotid anzeigen. Nachdem die Reaktion abgeschlossen ist, werden die Fragmente in einem als Kapillargelelektrophorese bezeichneten Prozess durch ein langes, dünnes Röhrchen geleitet, das eine Gelmatrix enthält. Kurze Fragmente bewegen sich schnell durch die Poren des Gels, während sich lange Fragmente langsamer bewegen. Wenn jedes Fragment die "Ziellinie" am Ende der Röhre überquert, wird es von einem Laser beleuchtet, wodurch der anhaftende Farbstoff erkannt werden kann.

Das kleinste Fragment (das nur ein Nukleotid nach dem Primer endet) überquert zuerst die Ziellinie, gefolgt vom nächstkleineren Fragment (das zwei Nukleotide nach dem Primer endet) und so weiter. So kann aus den nacheinander auf dem Detektor registrierten Farbstoffen die Sequenz des ursprünglichen DNA-Stücks Nukleotid für Nukleotid aufgebaut werden. Die vom Detektor aufgezeichneten Daten bestehen aus einer Reihe von Peaks der Fluoreszenzintensität, wie im Chromatogramm oben gezeigt. Die DNA-Sequenz wird von den Peaks im Chromatogramm abgelesen.

• MIKROSATELLITEN Die Mikrosatellitenanalyse umfasst die PCR-Amplifikation der Mikrosatelliten-Loci unter Verwendung von fluoreszenzmarkierten Primern (6-FAM, TET, HEX, NED); markierte PCR-Produkte werden dann durch Kapillarelektrophorese (ABI PRISM 310 und 3130 XL Applied Biosystem) (CE) oder Elektrophorese analysiert, um die Allele nach Größe zu trennen.

Die Ergebnisse wurden mit den Programmen GENESCAN und GENOTYPER5 verarbeitet. Sobald die Werte einzelner Allele festgelegt waren, wurden sie jedem Individuum zugeordnet.

• Sequenzierung der nächsten Generation (NGS)

Im Prinzip ähnelt das Konzept hinter der NGS-Technologie der CE-Sequenzierung – DNA-Polymerase katalysiert den Einbau von fluoreszenzmarkierten Desoxyribonukleotidtriphosphaten (dNTPs) in einen DNA-Matrizenstrang während aufeinanderfolgender Zyklen der DNA-Synthese. Während jedes Zyklus werden am Einbauort die Nukleotide durch Fluorophor-Anregung identifiziert. Der entscheidende Unterschied besteht darin, dass NGS, anstatt ein einzelnes DNA-Fragment zu sequenzieren, diesen Prozess massiv parallel auf Millionen von Fragmenten ausdehnt. Die Illumina Sequencing by Synthesis (SBS)-Chemie ist die am weitesten verbreitete Chemie in der Branche und liefert die höchste Genauigkeit, die höchste Ausbeute an fehlerfreien Reads und den höchsten Prozentsatz an Base-Calls über Q30.6-8 Die Illumina NGS-Workflows umfassen 4 grundlegende Schritte (Abbildung 3):

o Bibliotheksvorbereitung – Die Sequenzierungsbibliothek wird durch zufällige Fragmentierung der DNA- oder cDNA-Probe, gefolgt von 5'- und 3'-Adapterligation, hergestellt. Alternativ kombiniert die "Tagmentierung" die Fragmentierungs- und Ligationsreaktionen in einem einzigen Schritt, der die Effizienz des Bibliotheksvorbereitungsprozesses erheblich erhöht.9 Adapter-ligierte Fragmente werden dann PCR-amplifiziert und Gel-gereinigt.

o Cluster-Erzeugung – Zur Cluster-Erzeugung wird die Bibliothek in eine Fließzelle geladen, wo Fragmente auf einem Rasen aus oberflächengebundenen Oligos eingefangen werden, die komplementär zu den Bibliotheksadaptern sind. Jedes Fragment wird dann durch Brückenamplifikation in unterschiedliche klonale Cluster amplifiziert. Wenn die Cluster-Generierung abgeschlossen ist, sind die Vorlagen bereit für die Sequenzierung.

o Sequencing-Illumina-Technologie verwendet eine proprietäre reversible Terminator-basierte Methode, die einzelne Basen erkennt, wenn sie in DNA-Matrizenstränge eingebaut werden. Da alle 4 reversiblen terminatorgebundenen dNTPs während jedes Sequenzierungszyklus vorhanden sind, minimiert die natürliche Konkurrenz die Einbauverzerrung und reduziert die Rohfehlerraten im Vergleich zu anderen Technologien erheblich.6, 7 Das Ergebnis ist eine hochpräzise Base-für-Base-Sequenzierung, die sequenzkontextspezifische Fehler praktisch eliminiert, selbst innerhalb repetitiver Sequenzregionen und Homopolymere.

o Datenanalyse – Während der Datenanalyse und des Alignments werden die neu identifizierten Sequenz-Reads dann mit einem Referenzgenom abgeglichen. Nach dem Alignment sind viele Variationen der Analyse möglich, wie z. B. Single Nucleotide Polymorphism (SNP) oder Insertion-Deletion (Indel)-Identifikation, Read-Zählung für RNA-Methoden, phylogenetische oder metagenomische Analyse und mehr.

5. STATISTIK

Um die Pathogenität der Varianten zu bestimmen, werden wir durchgeführt:

• Molekularer Test in der Familie des Probanden.
• In-silico-Analyse durch Bioinformatik-Software (Sift: http://sift.jcvi.org/; PolyPhen: http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/).

• Häufigkeitsanalyse in der Allgemeinbevölkerung mit SNPs Banken (dbSNP: https: //www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/; EXAC: http://exac.broadinstitute.org/)

  6. ETHISCHE ASPEKTE Diese Studie folgt den ethischen Standards der Deklaration von Helsinki und ihren Überarbeitungen. Die Studie wird unter Berücksichtigung der regulatorischen Anforderungen und der Einhaltung der Gesetze durchgeführt. Die informierte Einwilligung wurde bereits zuvor von der Ethikkommission genehmigt.