Implementación de Vías de Diagnóstico Molecular

1. INTRODUCCIÓN

Para algunas enfermedades neurológicas y neurodegenerativas, la herencia genética está bien documentada y se han mejorado las directrices para garantizar un enfoque diagnóstico de calidad. Desafortunadamente, este escenario no es reproducible para la mayoría de los trastornos neurológicos y neurodegenerativos, incluso cuando se documenta un fuerte componente genético. Esto es debido a:

• Poligenicidad, donde diferentes genes pueden contribuir al mismo fenotipo (p. ej., paraplejia espástica, asociada con más de 50 genes)
• Enfermedades multifactoriales, la genética puede explicar solo una parte de la etiología de la enfermedad (como la enfermedad de Parkinson en la que los genes identificados son responsables de solo el 15% de los pacientes con un diagnóstico clínico)
• Trastornos con componente genético bien establecido, pero los genes responsables no han sido identificados.

Por lo tanto, a veces es imposible o poco probable completar un diagnóstico molecular para pacientes con fenotipos clásicos o complejos. Las nuevas tecnologías, como Next Generation Sequencing (NGS), permiten el análisis de cientos de genes en un solo experimento. La implementación de estas tecnologías ayudará a identificar nuevos genes y nuevas variantes asociadas

2. ESTUDIO DE DISEÑO

El objetivo de este estudio es mejorar el enfoque diagnóstico en genética molecular a través de NGS. Esto permitirá caracterizar variaciones genómicas y nuevos genes responsables de enfermedades neurológicas y neurodegenerativas. En particular, NGS identificará:

1. Nuevos genes asociados a enfermedades caracterizadas por heterogeneidad genética, herencia mendeliana y poligénica.

2. Nuevas variaciones responsables de enfermedades o que pueden aumentar la susceptibilidad genética.

3. FASE EXPERIMENTAL (Anexo 1)

1. Neurología y, en su caso, Consejo Genético.
2. El Consejo Genético identifica el análisis molecular para un paciente específico. Se recolectará una muestra de sangre de 6 mililitros previo consentimiento informado (consentimiento informado Neuromed versión 2.12.2015).
3. Se seguirán pautas específicas para cada prueba para el primer enfoque de diagnóstico. Los análisis moleculares se realizan en el Instituto de Genética Molecular Centro IRCCS INM Neuromed utilizando secuenciación de Sanger, amplificación de sonda dependiente de ligación multiplex (MLPA) y microsatélites.
4. Si el análisis específico no detecta las mutaciones, se aplicará un panel NGS que consta de 4.813 genes asociados con fenotipos clínicos conocidos (exoma clínico o mendelioma).

4. MATERIALES Y MÉTODOS

• EXTRACCIÓN DE ADN/ARN El ADN genómico se aislará de los leucocitos de sangre periférica de acuerdo con los procedimientos estándar. El ARN total se aislará de las células cultivadas utilizando el reactivo TRIzol (Invitrogen, Life Technologies) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La concentración y la pureza de las muestras de ADN/ARN se determinarán mediante Nanodrop 2000 (Thermo Scientific, Life Technologies).
• MLPA (Amplificación de sonda dependiente de ligación múltiple) MLPA (Amplificación de sonda dependiente de ligación múltiple) es un método de PCR múltiple que detecta números de copias anormales de hasta 50 secuencias de ADN o ARN genómico diferentes, que es capaz de distinguir secuencias que difieren en un solo nucleótido.

Típico de MLPA es que no son las secuencias diana las que se amplifican, sino las sondas MLPA que hibridan con la secuencia diana. A diferencia de una PCR multiplex estándar, se utiliza un solo par de cebadores de PCR para la amplificación de MLPA. Los productos de amplificación resultantes de los kits SALSA MLPA varían entre 130 y 480 nt de longitud y pueden analizarse mediante electroforesis capilar. La comparación del patrón de pico obtenido con el de las muestras de referencia indica qué secuencias muestran números de copias anómalos.

La reacción de MLPA se puede dividir en cinco pasos principales: 1) desnaturalización del ADN e hibridación de sondas de MLPA; 2) reacción de ligadura; 3) reacción de PCR; 4) separación de productos de amplificación por electroforesis; y 5) análisis de datos

• SECUENCIACIÓN

La muestra de ADN a secuenciar se combina en un tubo con cebador, ADN polimerasa y nucleótidos de ADN (dATP, dTTP, dGTP y dCTP). También se añaden los cuatro didesoxinucleótidos que terminan la cadena, marcados con tinte, pero en cantidades mucho más pequeñas que los nucleótidos ordinarios.

La mezcla primero se calienta para desnaturalizar el ADN molde (separar las hebras), luego se enfría para que el cebador pueda unirse al molde monocatenario. Una vez que el cebador se ha unido, la temperatura se eleva nuevamente, lo que permite que la ADN polimerasa sintetice nuevo ADN a partir del cebador. La ADN polimerasa continuará agregando nucleótidos a la cadena hasta que agregue un didesoxinucleótido en lugar de uno normal. En ese momento, no se pueden agregar más nucleótidos, por lo que la hebra terminará con el didesoxinucleótido.

Este proceso se repite en varios ciclos. Cuando se completa el ciclo, está prácticamente garantizado que se habrá incorporado un didesoxinucleótido en cada posición individual del ADN objetivo en al menos una reacción. Es decir, el tubo contendrá fragmentos de diferentes longitudes, que terminarán en cada una de las posiciones de los nucleótidos en el ADN original (ver la figura a continuación). Los extremos de los fragmentos se marcarán con colorantes que indiquen su nucleótido final. Una vez finalizada la reacción, los fragmentos se pasan por un tubo largo y delgado que contiene una matriz de gel en un proceso llamado electroforesis en gel capilar. Los fragmentos cortos se mueven rápidamente a través de los poros del gel, mientras que los fragmentos largos se mueven más lentamente. A medida que cada fragmento cruza la "línea de meta" al final del tubo, se ilumina con un láser, lo que permite detectar el tinte adherido.

El fragmento más pequeño (que termina solo un nucleótido después del cebador) cruza la línea de meta primero, seguido por el siguiente fragmento más pequeño (que termina dos nucleótidos después del cebador), y así sucesivamente. Así, a partir de los colores de los tintes registrados uno tras otro en el detector, la secuencia de la pieza original de ADN puede construirse un nucleótido a la vez. Los datos registrados por el detector consisten en una serie de picos en la intensidad de la fluorescencia, como se muestra en el cromatograma anterior. La secuencia de ADN se lee de los picos en el cromatograma.

• MICROSATELITE El análisis de microsatélites incluye la amplificación por PCR de los loci de microsatélites utilizando cebadores marcados con fluorescencia (6-FAM, TET, HEX, NED); A continuación, los productos de PCR marcados se analizan mediante electroforesis capilar (ABI PRISM 310 y 3130 XL Applied Biosystem) (CE) o electroforesis para separar los alelos por tamaño.

Los resultados fueron procesados ​​mediante los programas GENESCAN y GENOTYPER5. Una vez establecidos los valores de los alelos individuales, se asignaron a cada individuo.

• SECUENCIACIÓN DE PRÓXIMA GENERACIÓN (NGS)

En principio, el concepto detrás de la tecnología NGS es similar a la secuenciación CE: la ADN polimerasa cataliza la incorporación de trifosfatos de desoxirribonucleótidos (dNTP) marcados con fluorescencia en una hebra de plantilla de ADN durante ciclos secuenciales de síntesis de ADN. Durante cada ciclo, en el punto de incorporación, los nucleótidos son identificados por excitación con fluoróforo. La diferencia crítica es que, en lugar de secuenciar un solo fragmento de ADN, NGS extiende este proceso a millones de fragmentos de forma masivamente paralela. La química de secuenciación por síntesis (SBS) de Illumina es la química más adoptada en la industria y ofrece la mayor precisión, el mayor rendimiento de lecturas sin errores y el mayor porcentaje de llamadas base por encima de Q30.6-8 Los flujos de trabajo de Illumina NGS incluyen 4 pasos básicos (Figura 3):

o Preparación de la biblioteca: la biblioteca de secuenciación se prepara mediante la fragmentación aleatoria de la muestra de ADN o ADNc, seguida de la ligadura del adaptador 5' y 3'. Alternativamente, la "tagmentación" combina las reacciones de fragmentación y ligadura en un solo paso que aumenta en gran medida la eficiencia del proceso de preparación de bibliotecas.9 A continuación, los fragmentos ligados al adaptador se amplifican por PCR y se purifican en gel.

o Generación de grupos: para la generación de grupos, la biblioteca se carga en una celda de flujo donde los fragmentos se capturan en un césped de oligos unidos a la superficie complementarios a los adaptadores de la biblioteca. Luego, cada fragmento se amplifica en grupos clonales distintos a través de la amplificación de puente. Cuando se completa la generación de grupos, las plantillas están listas para la secuenciación.

o La tecnología Sequencing-Illumina utiliza un método patentado basado en terminadores reversibles que detecta bases individuales a medida que se incorporan a las hebras de plantilla de ADN. Como los 4 dNTP unidos al terminador reversible están presentes durante cada ciclo de secuenciación, la competencia natural minimiza el sesgo de incorporación y reduce en gran medida las tasas de error bruto en comparación con otras tecnologías.6, 7 El resultado es una secuenciación base por base de alta precisión que prácticamente elimina los errores específicos del contexto de la secuencia, incluso dentro de regiones de secuencias repetitivas y homopolímeros.

o Análisis de datos: durante el análisis y la alineación de datos, las lecturas de secuencia recién identificadas se alinean con un genoma de referencia. Después de la alineación, son posibles muchas variaciones de análisis, como polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) o identificación de inserción-deleción (indel), recuento de lecturas para métodos de ARN, análisis filogenético o metagenómico, y más.

5. ESTADÍSTICAS

Para determinar la patogenicidad de las variantes se realizará:

• Prueba molecular en la familia del probando.
• Análisis in-silico por software de bioinformática (Sift: http://sift.jcvi.org/; PolyPhen: http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/).

• Análisis de frecuencia en población general con SNPs Banks (dbSNP: https: //www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/; EXAC: http://exac.broadinstitute.org/)

  6. ASPECTOS ÉTICOS Este estudio sigue las normas éticas de la Declaración de Helsinki y sus revisiones. El estudio se realizará teniendo en cuenta los requisitos reglamentarios y el cumplimiento de la ley. El consentimiento informado ya aprobado previamente por el comité de ética.