Mikrobiom und flüchtige organische Verbindungen bei Patienten mit CDH (CDHVOCS)

Ziel: Ziel dieser Studie ist es, aufgenommene Kinder anhand eines Leistenbruchs, des Lungenmikrobioms und der flüchtigen organischen Verbindungen (VOC) in der Ausatemluft zu bewerten und mit einer Kontrollgruppe zu vergleichen, die keinen Leistenbruch hat chronische oder akute Lungenerkrankung. Weiterhin kann die Lungenfunktion durch Spirometrie, Ganzkörper-Plethysmographie und „Multiple Breath Washout“-Verfahren genau erfasst und eine sportmedizinische Untersuchung inkl. Ergospirometrie durchgeführt werden. Darüber hinaus wird der Einfluss von Probiotika auf das pulmonale Mikrobiom bei Kindern mit Zwerchfellbruch untersucht.

Studiendesign: Dies ist eine prospektive Studie bei Kindern, die in der frühen Kindheit wegen eines angeborenen Zwerchfellbruchs operiert wurden. Nach einer initialen Bestimmung des Mikrobioms und der Zusammensetzung flüchtiger organischer Substanzen in Atemluft und Kot und einer Lungenfunktionsmessung sowie sportmedizinischer Untersuchung erhält die Studiengruppe ein Probiotikum (Omnibiotics 6, bezogen vom Institut Allergosan, Nahrungsergänzungsmittel) für 3 Monate. Anschließend werden das Mikrobiom und die VOCs beobachtet. Die Probanden werden nach Alter, Geschlecht, Pflege mit oder ohne Pflaster eingeteilt. Zusätzlich erfolgt ein Vergleich mit einer Kontrollgruppe, die keine chronische oder akute Lungenerkrankung aufweist, nach Alter und Geschlecht der Testgruppe. Zusätzlich soll in Kooperation mit der Klinischen Abteilung für Pädiatrische Pneumologie und Allergologie der Universitätsklinik für Kinder- und Jugendmedizin der Medizinischen Universität Graz die Lungenfunktion ehemaliger Zwerchfellbruch-Patienten (vor Gabe von Probiotika) und einer Kontrollgruppe gemessen werden . In Kooperation mit dem Medizinischen Zentrum für Sportmedizin führt der Prüfarzt auch eine sportmedizinische Untersuchung inklusive Ergospirometrie durch. Die Studiendauer ist auf 12 Monate festgelegt.

Studienteilnehmer: Studiengruppe: Kinder zwischen 6-16 Jahren, die zwischen 2000 und 2010 an der Universitätsklinik für Kinder- und Jugendchirurgie der Medizinischen Universität Graz wegen eines angeborenen Zwerchfellbruchs immatrikuliert wurden, haben einen operativen Verschluss mit oder ohne erhalten Patch. Kontrollgruppe: Kinder zwischen 6-16 Jahren, die keine Lungenerkrankung haben. Rekrutiert aus dem ambulanten Bereich der Universitätsklinik für Kinder- und Jugendchirurgie der Medizinischen Universität Graz. Ziel ist es, mit einem Informationsschreiben Kontakt zu den oben genannten Patienten und deren Eltern herzustellen und die Bereitschaft zur Teilnahme an dieser Studie zu erreichen. Die Kontrollgruppe sollte nach entsprechender Information und eventuellem Einverständnis aus dem ambulanten Bereich der Universitätsklinik für Kinder- und Jugendchirurgie der Medizinischen Universität Graz kommen.

Mikrobiomanalyse vor Behandlung mit einem Probiotikum: Gewinnung von Probenmaterial – in diesem Fall Sputum – aus den tiefen Atemwegen durch induziertes Sputum nach Inhalation von hypersaliner Kochsalzlösung mit daraus resultierender Hustenprovokation. Anschließend wird die Probe tiefgefroren. Die Mikrobiommessung wird als vergleichendes 16S-rDNA-basiertes Profil über Chip-basiertes Next-Generation-Sequencing wie bereits veröffentlicht durchgeführt, analysiert mit SnowMAn, Qiime und MOTHUR sowie der eigenen „R“-basierten Software. Eine Sequenzierungstiefe von 5.000–10.000 Reads pro Probe.

VOC-Analyse vor der Behandlung mit einem Probiotikum: I) Entnahme der ausgeatmeten Gasproben: Jedem Probanden (n = 3) wird eine Probe aus der Inspiration und zwei aus der Exspiration entnommen. Verwenden Sie für die Probenahme ein automatisches Probenahmesystem, das direkt mit einem Kapnometer verbunden ist. Dieses System beinhaltet als Mikroextraktionstechnik eine sogenannte Nadelfallen-Mikroextraktion (NTME) und erfüllt die Anforderungen einer optimalen Probenahme auf derzeit technisch höchstem Niveau. Die so gewonnenen Ausatemgasproben werden dann zur Analyse an unseren Kooperationspartner, an das Institut für Atemgasanalytik der Universität Rostock geschickt. II) Analyse ausgeatmeter Gasproben: Dort werden die ausgeatmeten Gasproben in einem Injektor eines Chromatographen thermisch in den inerten Trägergasstrom (He) überführt. Die Substanzen werden nach ihrer Retentionszeit im Chromatogramm und ihrem Massenspektrum zugeordnet. Unbekannte Verbindungen im ausgeatmeten Gas werden durch Vergleich mit einer Referenzdatenbank basierend auf dem Massenspektrum identifiziert. Vital- und Labordaten sowie mikrobiologische Informationen werden den Befunden der Patienten entnommen. III) Identifizierung von Biomarkern von ausgeatmeten Gasproben: Aus den Ergebnissen der Patientenmessungen werden diejenigen Stoffe und Stoffkonzentrationen ermittelt, die spezifisch für die Studiengruppe 1 und Gruppe 2 sind, also Verbindungen, die in der Vergleichsgruppe nicht oder nur in signifikantem Umfang vorhanden sind niedrigere oder höhere Konzentrationen. Die ausgewählten flüchtigen Marker sowie eventuell in der Umwelt nachgewiesene flüchtige Schadstoffe werden in einer analytischen Referenzdatenbank gespeichert und nach Eliminierung der Kontamination zu möglicherweise krankheitsspezifischen Markerprofilen gebündelt. IV) Analyse von Stuhlproben: Die Stuhlproben werden ebenfalls an das Institut für Atemgasanalytik der Universität Rostock zur Analyse geschickt und dort nach entsprechender Anreicherung durch Festphasenmikroextraktion (SPME) analysiert. V) Identifizierung von Biomarkern von Kotproben: Dies erfolgt in Analogie zu den ausgeatmeten Gasproben.

Lungenfunktionsmessung vor Behandlung mit einem Probiotikum: Messung der Lungenfunktion mittels Spirometrie und Bodyplethysmographie (Fa Jäger Spirometer und Bodyplethysmograph) und Stickstoffauswaschverfahren (N2-Multiple Breath Washout, System Exhalyzer D und Spiroware 3.1, Eco Medics AG, Dürnten, Schweiz). Spirometrie und Bodyplethysmographie werden gemäß den veröffentlichten ERS/ATS-Standards durchgeführt. Das „Multiple Breath Washout“-Verfahren wird unter Ruheatmung durchgeführt und erfasst die Ventilations(in)homogenität auf der Höhe der funktionellen Residualkapazität (= FRC = jenes Lungenvolumen, das nach einer ruhigen spontanen Ausatmung noch in der Lunge verbleibt) . Das System besteht aus einem Durchflussmesser, einem schnell analysierenden Gasmesssystem, einem Gasverwaltungssystem und der dazugehörigen Computeranalysesoftware. Als „Fremdgas“ werden dabei 78 % des in der Luft vorkommenden Gases Stickstoff (N2) verwendet. Eine Fluss-Volumen-Messung erfolgt über ein Ultraschall-Durchflussmessgerät direkt im Ein- und Ausatemstrom des Probanden/Patienten und über einen Laser-O2-Sensor im Seitenstrom-Messverfahren und einen Infrarot-CO2-Sensor im Hauptstrom-Messverfahren (= direkt im Atemstrom des Patienten) die jeweilige Gaskonzentration. Der N2-Anteil wird dann indirekt über die O2- und CO2-Konzentration gemessen (N2 = 1 - O2 - CO2). Bei ruhiger Spontanatmung bekommt der Patient über ein Schnorchelmundstück über einen Bakterienfilter durch den Flowmeter 100 % Sauerstoff und „wäscht“ damit N2 aus („N2-Multiple Breath Washout“). Dabei wird die Fluss-Volumen-Kurve der Spontanatmung „online“ auf dem Bildschirm angezeigt und die Messung bei Erreichen von 1/40 (= 2,5 %) der anfänglichen Stickstoffkonzentration abgeschlossen. Warten Sie danach, ob der Proband ungefähr die doppelte Dauer der Messung hat, um den Sauerstoff auszuatmen. Danach folgt die nächste Messung. Insgesamt 3 Messungen, deren Mittelwert als Ergebnis dient. Der sogenannte "Lungen-Clearance-Index", der die Anzahl der funktionellen Restkapazitäts-Lungenvolumina angibt, die verwendet werden können, um die anfängliche Stickstoffkonzentration auf 1/40 zu reduzieren, nachdem eine Oxygenierung erforderlich war. (LCI = Quotient aus ausgeatmetem Volumen und FRC). Sie drückt aus, wie lange es dauert, bis das eingeatmete Gas (in unserem Fall der physiologisch vorkommende Stickstoff in der Luft) durch Einatmen 100 % Sauerstoff enthält. Dieser Wert liegt bei Gesunden im Mittel bei 7 und ist bei Lungenpatienten deutlich höher. Weitere Messparameter, die einerseits eine Aussage über die peripheren Atemwege proximal der terminalen Bronchiolen und andererseits über die weiter distal gelegenen Azin-Atemwege treffen, werden berechnet.

Sportmedizinische Untersuchung: Zum Ausschluss von Kontraindikationen für die Ergometrie wird zu Beginn der Untersuchung ein 12-Kanal-Ruhe-EKG und eine Ruhe-Blutdruckmessung (CombynTM Function & Spaces ECG, Academic Technologies) durchgeführt. Nach Erhebung der anthropometrischen Daten (Größe, Gewicht, BMI) werden die Muskel- und Fettmasse durch Multifrequenz-Impedanzmessung in sechs Körpersegmenten bestimmt (CombynTM Function & Spaces ECG, Academic Technologies). Die Lungenfunktion wird mittels kleiner Spirometrie in Ruhe und nach Belastung gemessen (Spirometer Oxycon Pro, Reiner). Zur Bestimmung der kardiopulmonalen Leistungsfähigkeit wird eine Ergospirometrie auf einem Fahrrad (Ergometer Excalibur Sport, Fa. Lode; Spiroergometriegerät Oxycon Pro, Fa. Reiner) mit allmählich steigender Belastung bis zur subjektiven Erschöpfung durchgeführt. Die Auswertung dieser Daten erlaubt neben der Bestimmung der aeroben Leistungsfähigkeit auch Rückschlüsse auf das leistungsbegrenzende System (Herz-Kreislauf-System, Lunge, Muskulatur).

Mikrobiom-/VOC-Analyse nach Behandlung mit einem Probiotikum: Nach Probenahme zur Mikrobiom- und VOC-Analyse sowie Durchführung von Lungenfunktionsmessungen und sportmedizinischer Untersuchung nehmen die Teilnehmer der Studiengruppe ein Probiotikum (Omnibiotic 6, bezogen vom Institut Allergosan, Nahrungsergänzungsmittel ) für einen Zeitraum von 3 Monaten. Unmittelbar danach und einen weiteren Monat später werden Messungen des Lungenmikrobioms und der VOCs in der Atemluft durchgeführt.