Mikrobiom i lotne związki organiczne u pacjentów z CDH (CDHVOCS)

Cel: Celem pracy jest ocena dzieci zakwalifikowanych na podstawie przepukliny, mikrobiomu płucnego oraz lotnych związków organicznych (LZO) w wydychanym powietrzu i porównanie ich z grupą kontrolną, która nie przewlekła lub ostra choroba płuc. Ponadto funkcja płuc jest dokładnie rejestrowana za pomocą spirometrii, pletyzmografii całego ciała i procedur „wielokrotnego wypłukiwania oddechu” oraz badania lekarskiego sportowego, w tym ergospirometrii. Ponadto zbadany zostanie wpływ probiotyków na mikrobiom płucny u dzieci z przepukliną przeponową.

Projekt badania: Jest to prospektywne badanie z udziałem dzieci leczonych chirurgicznie we wczesnym dzieciństwie z powodu wrodzonej przepukliny przeponowej. Po wstępnym oznaczeniu mikrobiomu i składu lotnych substancji organicznych w powietrzu oddechowym i kale oraz pomiarze czynności płuc i badaniu lekarskim grupa badana otrzymuje probiotyk (Omnibiotyki 6, pozyskane z Instytutu Allergosan, suplementy diety) przez 3 miesiące. Następnie obserwuje się mikrobiom i LZO. Badanych podzielono ze względu na wiek, płeć, pielęgnację z plastrem lub bez. Ponadto dokonuje się porównania z grupą kontrolną, która nie wykazuje żadnej przewlekłej lub ostrej choroby płuc, zgodnie z wiekiem i płcią grupy testowej. Ponadto, we współpracy z Oddziałem Pulmonologii i Alergologii Dziecięcej Kliniki Pediatrii i Medycyny Młodzieży Uniwersytetu Medycznego w Grazu, ma zostać zmierzona czynność płuc pacjentów po przepuklinach przeponowych (przed podaniem probiotyków) oraz grupa kontrolna . We współpracy z Centrum Medycznym Medycyny Sportowej badacz wykonuje również sportowe badanie lekarskie obejmujące ergospirometrię. Czas trwania badania ustalono na 12 miesięcy.

Uczestnicy badania: Grupa badana: Dzieci w wieku od 6 do 16 lat, które w latach 2000-2010 zostały przyjęte do Kliniki Chirurgii Dziecięcej i Młodzieżowej Uniwersytetu Medycznego w Grazu z powodu wrodzonej przepukliny przeponowej, które zostały zamknięte operacyjnie z lub bez skrawek. Grupa kontrolna: Dzieci w wieku 6-16 lat bez chorób płuc. Rekrutowany z obszaru ambulatoryjnego Kliniki Chirurgii Dziecięcej i Młodzieżowej Uniwersytetu Medycznego w Grazu. Celem jest nawiązanie kontaktu z wyżej wymienionymi pacjentami i ich rodzicami oraz uzyskanie chęci udziału w badaniu za pomocą listu informacyjnego. Grupa kontrolna powinna pochodzić z terenu ambulatorium Kliniki Chirurgii Dziecięcej i Młodzieżowej Uniwersytetu Medycznego w Grazu, po stosownym poinformowaniu i ewentualnej zgodzie.

Analiza mikrobiomu przed podaniem probiotyku: Pobranie materiału do badania – w tym przypadku plwociny – z głębokich dróg oddechowych poprzez indukcję plwociny po inhalacji roztworu soli fizjologicznej z prowokacją kaszlu. Próbka jest następnie głęboko zamrażana. Pomiar mikrobiomu jest wykonywany jako porównawczy profil oparty na rDNA 16S za pomocą opartego na chipach sekwencjonowania nowej generacji, jak już opublikowano, analizowanego przy użyciu SnowMAN, Qiime i MOTHUR, a także własnego oprogramowania opartego na „R”. Głębokość sekwencjonowania 5 000-10 000 odczytów na próbkę.

Analiza LZO przed leczeniem probiotykiem: I) Pobieranie próbek wydychanego gazu: Od każdego badanego pobiera się jedną próbkę z wdechu i dwie z wydechu (n = 3). Do pobierania próbek badacz używa automatycznego systemu pobierania próbek, który jest bezpośrednio podłączony do kapnometru. System ten zawiera tzw. mikroekstrakcję igły-pułapki (NTME) jako technikę mikroekstrakcji i spełnia wymagania optymalnego pobierania próbek na obecnie najwyższym technicznie poziomie. Uzyskane w ten sposób próbki gazów wydechowych są następnie przesyłane do analizy do naszego partnera współpracującego, Instytutu Analizy Gazów Oddechowych Uniwersytetu w Rostocku. II) Analiza próbek wydychanego gazu: Tam próbki wydychanego gazu są termicznie przenoszone do strumienia obojętnego gazu nośnego (He) we wtryskiwaczu chromatografu. Substancje są przyporządkowywane według ich czasu retencji na chromatogramie i ich widma masowego. Nieznane Związki w wydychanym gazie są identyfikowane przez porównanie z referencyjną bazą danych opartą na widmie masowym. Dane życiowe i laboratoryjne, a także informacje mikrobiologiczne pochodzą z wyników badań pacjentów. III) Identyfikacja biomarkerów próbek gazów wydychanych: Na podstawie wyników pomiarów pacjentów określa się te substancje i stężenia substancji, które są specyficzne dla grupy badawczej 1 i grupy 2, czyli związków, które nie występują w grupie porównawczej lub występują tylko w istotnie niższe lub wyższe stężenia. Wybrane lotne markery, a także wszelkie lotne zanieczyszczenia, które mogły zostać wykryte w środowisku, są przechowywane w analitycznej referencyjnej bazie danych, a po wyeliminowaniu zanieczyszczenia są łączone w profile markerów prawdopodobnie specyficznych dla choroby. IV) Analiza próbek kału: Próbki kału są również przesyłane do Instytutu Analizy Gazów Oddechowych Uniwersytetu w Rostoku w celu analizy i tam analizowane po odpowiednim wstępnym zatężeniu metodą mikroekstrakcji do fazy stałej (SPME). V) Identyfikacja biomarkerów próbek kału: Odbywa się to analogicznie do próbek wydychanego gazu.

Pomiar czynności płuc przed podaniem probiotyku: Pomiar czynności płuc za pomocą spirometrii i pletyzmografii ciała (spirometr Fa Jäger i pletyzmograf ciała) oraz procesu wypłukiwania azotu (N2-wielokrotne wypłukiwanie oddechu, System Exhalyzer D i Spiroware 3.1, Eco Medics AG, Duernten, Szwajcaria). Spirometria i pletyzmografia ciała są wykonywane zgodnie z opublikowanymi standardami ERS/ATS. Metoda „wielokrotnego wypłukiwania oddechów” jest wykonywana podczas oddychania spoczynkowego i wykrywa (nie)jednorodność wentylacji na poziomie funkcjonalnej pojemności resztkowej (= FRC = ta objętość płuc, która nadal pozostaje w płucach po spokojnym, spontanicznym wydechu, pozostaje w tyle) . System składa się z przepływomierza, systemu pomiaru gazu do szybkiej analizy, systemu zarządzania gazem oraz odpowiedniego oprogramowania komputerowego do analizy. Jako „gaz obcy” będzie zużywał 78% gazu występującego w powietrzu azotu (N2). Pomiar przepływu-objętości jest wykonywany za pomocą przepływomierza ultradźwiękowego bezpośrednio w przepływie wdechowym i wydechowym badanej osoby/pacjenta oraz za pomocą laserowego czujnika O2 przy użyciu metody pomiaru prądu bocznego oraz czujnika CO2 na podczerwień w głównej procedurze pomiaru prądu (= bezpośrednio w przepływie oddechowym pacjenta) odpowiednie stężenie gazu. Składnik N2 jest następnie mierzony pośrednio poprzez stężenie O2 i CO2 (N2 = 1 - O2 - CO2). Podczas spokojnego oddychania spontanicznego Pacjent na ustniku fajki przez filtr bakteryjny przez przepływomierz 100% tlenu iw ten sposób „wypłukuje” N2 („N2-wielokrotne wypłukiwanie oddechu”). W ten sposób krzywa przepływ-objętość spontanicznego oddychania jest wyświetlana „online” na ekranie, a pomiar przy osiągnięciu 1/40 (= 2,5%) początkowego stężenia azotu jest zakończony. Następnie należy odczekać, aby badany był bezpieczny na długości dwukrotnie dłuższej niż czas pomiaru wokół wydychanego tlenu. Po tym następuje kolejny pomiar. W sumie 3 pomiary, których średnia służy jako wynik. Tak zwany „wskaźnik klirensu płucnego”, który wskazuje liczbę funkcjonalnych objętości resztkowych płuc, które można wykorzystać do zmniejszenia początkowego stężenia azotu do 1/40 po wymaganym natlenieniu. (LCI = iloraz objętości wydechu i FRC). Wyraża, jak długo trwa wdychanie gazu (w naszym przypadku fizjologicznie występującego azotu w powietrzu) ​​poprzez wdychanie 100% tlenu. Dla osób zdrowych wartość ta wynosi średnio 7 i jest znacznie wyższa u pacjentów z płucami. Obliczane są dalsze parametry pomiarowe, które określają z jednej strony obwodowe drogi oddechowe proksymalne do oskrzelików końcowych, az drugiej strony biegnące przez bardziej dystalne azynowe drogi oddechowe.

Sportowe badanie lekarskie: Aby wykluczyć przeciwwskazania do ergometrii, na początku badania wykonywane jest 12-kanałowe spoczynkowe EKG oraz pomiar ciśnienia krwi (CombynTM Function & Spaces ECG, Academic Technologies). Po zebraniu danych antropometrycznych (wzrost, waga, BMI) określa się masę mięśniową i tłuszczową za pomocą wieloczęstotliwościowego pomiaru impedancji w sześciu segmentach ciała (CombynTM Function & Spaces ECG, Academic Technologies). Czynność płuc mierzy się za pomocą małej spirometrii w spoczynku i po wysiłku (Spirometer Oxycon Pro, Reiner). W celu określenia wydolności krążeniowo-oddechowej wykonuje się ergospirometrię na rowerze (ergometr Excalibur Sport firmy Lode; aparat spiroergometryczny Oxycon Pro firmy Reiner) ze stopniowym narastaniem stresu aż do subiektywnego wyczerpania. Ocena tych danych pozwala, oprócz określenia wydolności tlenowej, na wyciągnięcie wniosków na temat układu ograniczającego wydolność (układ sercowo-naczyniowy, płuca, mięśnie).

Analiza mikrobiomu/LZO po leczeniu probiotykiem: Po pobraniu próbek do analizy mikrobiomu i LZO oraz wykonaniu pomiarów czynności płuc i badania sportowo-lekarskiego uczestnicy grupy badanej przyjmują probiotyk (Omnibiotyk 6, zakupiony w Instytucie Allergosan, suplement diety ) na okres 3 miesięcy. Bezpośrednio potem i kolejny miesiąc później wykonuje się pomiary mikrobiomu płucnego i lotnych związków organicznych w wydychanym powietrzu.