Mikrobiom a těkavé organické sloučeniny u pacientů s CDH (CDHVOCS)

Cíl: Cílem této studie je zhodnotit děti, které byly zařazeny na základě kýly, plicního mikrobiomu a těkavých organických látek (VOC) ve vydechovaném vzduchu a porovnat je s kontrolní skupinou, která nemá chronické nebo akutní onemocnění plic. Dále bude precizně zaznamenána funkce plic pomocí spirometrie, celotělové pletysmografie a procedur „multiple breath washout“ a sportovní lékařské vyšetření včetně ergospirometrie. Dále bude zkoumán vliv probiotik na plicní mikrobiom u dětí s brániční kýlou.

Design studie: Jedná se o prospektivní studii u dětí, které byly v raném dětství chirurgicky léčeny pro vrozenou brániční kýlu. Po úvodním stanovení mikrobiomu a složení těkavých organických látek v dýchaném vzduchu a stolici a změření plicních funkcí a sportovního lékařského vyšetření obdrží studijní skupina probiotika (omnibiotika 6, získané z Allergosan Institute, doplňky stravy) po dobu 3 měsíců. Poté jsou pozorovány mikrobiom a VOC. Subjekty jsou rozděleny podle věku, pohlaví, péče s náplastí nebo bez ní. Kromě toho je provedeno srovnání s kontrolní skupinou, která nevykazuje žádné chronické nebo akutní plicní onemocnění podle věku a pohlaví testované skupiny. Kromě toho má být ve spolupráci s oddělením dětské pneumologie a alergologie Kliniky dětského a dorostového lékařství Lékařské univerzity ve Štýrském Hradci změřena plicní funkce u bývalých pacientů s brániční kýlou (před podáním probiotik) a kontrolní skupinou. . Ve spolupráci s Medicínským centrem sportovního lékařství vyšetřovatel provádí také sportovně lékařské vyšetření včetně ergospirometrie. Délka studia je stanovena na 12 měsíců.

Účastníci studie: Studijní skupina: Děti ve věku 6-16 let, které jsou zapsány na Klinice dětské a dorostové chirurgie Lékařské univerzity ve Štýrském Hradci v letech 2000 až 2010 z důvodu vrozené brániční kýly, podstoupily operační uzávěr s nebo bez náplast. Kontrolní skupina: Děti mezi 6-16 lety, které nemají plicní onemocnění. Rekrutován z ambulantní oblasti na Klinice dětské a dorostové chirurgie Lékařské univerzity v Grazu. Cílem je navázat kontakt s výše uvedenými pacienty a jejich rodiči a prostřednictvím informačního dopisu dosáhnout ochoty zúčastnit se této studie. Kontrolní skupina by měla po příslušné informaci a případném souhlasu pocházet z ambulantní oblasti Kliniky dětské a dorostové chirurgie Lékařské univerzity v Grazu.

Analýza mikrobiomu před léčbou probiotikem: Odběr materiálu vzorku – v tomto případě sputa – z hlubokých dýchacích cest indukovaným sputem po inhalaci hypersolného solného roztoku s následnou provokací kašle. Vzorek se poté hluboce zmrazí. Měření mikrobiomu se provádí jako srovnávací profil založený na 16S rDNA pomocí čipového sekvenování nové generace, jak již bylo publikováno, analyzovaného pomocí SnowMAn, Qiime a MOTHUR, stejně jako vlastního softwaru založeného na „R“. Hloubka sekvenování 5 000–10 000 čtení na vzorek.

Analýza VOC před léčbou probiotikem: I) Odběr vzorků vydechovaného plynu: Každému subjektu se odebere jeden vzorek z nádechu a dva z výdechu (n = 3). Pro vzorkování vyšetřovatel používá automatický vzorkovací systém, který je přímo připojen ke kapnometru. Tento systém obsahuje tzv. jehlovou mikroextrakci (NTME) jako mikroextrakční techniku ​​a splňuje požadavky na optimální odběr vzorků na v současnosti technicky nejvyšší úrovni. Takto získané vzorky vydechovaných plynů jsou následně zasílány k analýze našemu kooperačnímu partnerovi, do Institutu pro analýzu dýchacích plynů Univerzity v Rostocku. II) Analýza vzorků vydechovaných plynů: Zde se vzorky vydechovaných plynů tepelně přenášejí do proudu inertního nosného plynu (He) v injektoru chromatografu. Látky jsou přiřazeny podle jejich retenčního času v chromatogramu a jejich hmotnostního spektra. Neznámé sloučeniny ve vydechovaném plynu jsou identifikovány porovnáním s referenční databází na základě hmotnostního spektra. Vitální a laboratorní údaje a také mikrobiologické informace jsou přebírány z nálezů pacientů. III) Identifikace biomarkerů vzorků vydechovaných plynů: Z výsledků měření pacientů se stanoví ty látky a koncentrace látek, které jsou specifické pro studijní skupinu 1 a skupinu 2, tj. sloučeniny, které nejsou přítomny ve srovnávací skupině nebo pouze ve významně nižší nebo vyšší koncentrace. Vybrané těkavé markery, stejně jako jakékoli těkavé kontaminanty, které mohly být detekovány v prostředí, jsou uloženy v analytické referenční databázi a po odstranění kontaminace jsou sdruženy do profilů markerů, které mohou být specifické pro onemocnění. IV) Analýza vzorků stolice: Vzorky stolice se rovněž zasílají k analýze do Institutu pro analýzu dýchacích plynů Univerzity v Rostocku a tam se analyzují po vhodné předkoncentraci mikroextrakce na pevné fázi (SPME). V) Identifikace biomarkerů vzorků stolice: To se provádí analogicky jako vzorky vydechovaného plynu.

Měření funkce plic před léčbou probiotikem: Měření funkce plic pomocí spirometrie a tělesné pletysmografie (spirometr Fa Jäger a tělový pletysmograf) a proces vymývání dusíkem (N2-multiple breath washout, System Exhalyzer D a Spiroware 3.1, Eco Medics AG, Duernten, Švýcarsko). Spirometrie a tělesná pletysmografie se provádějí podle publikovaných standardů ERS/ATS. Metoda „multiple breath washout“ se provádí za klidového dýchání a detekuje ventilační (ne)homogenitu na úrovni funkční reziduální kapacity (= FRC = ten objem plic, který je ještě v plicích po klidném spontánním výdechu, je zanechán) . Systém se skládá z průtokoměru, systému pro rychlou analýzu plynů, systému pro podávání plynu a odpovídajícího softwaru pro počítačovou analýzu. Jako "cizí plyn" bude využito 78 % plynu ve vzduchu vyskytujícího se dusíku (N2). Měření průtoku a objemu se provádí pomocí ultrazvukového průtokoměru prováděného přímo v nádechu a výdechu testované osoby/pacienta a pomocí laserového senzoru O2 pomocí metody měření bočního proudu a infračerveného senzoru CO2 v postupu měření hlavního proudu (= přímo v dýchacím toku pacienta) příslušnou koncentraci plynu. Složka N2 je pak nepřímo měřena prostřednictvím koncentrace O2 a CO2 (N2 = 1 - O2 - CO2). Při klidném spontánním dýchání Pacient na šnorchlovacím náustku přes bakteriální filtr přes průtokoměr 100% kyslík a tím „vymývá“ N2 („N2-multiple breath washout“). Přitom se na obrazovce zobrazí křivka průtok-objem spontánního dýchání „online“ a měření při Dosažení 1/40 (= 2,5 %) počáteční koncentrace dusíku je dokončeno. Poté počkejte, je subjekt v bezpečí v délce dvojnásobku doby trvání měření kolem kyslíku ve výdechu. Následuje další měření. Celkem 3 měření, jejichž střední hodnota slouží jako výsledek. Takzvaný „index plicní clearance“, který udává počet funkčních objemů plicní reziduální kapacity, které lze použít ke snížení počáteční koncentrace dusíku na 1/40 po požadované oxygenaci. (LCI = podíl mezi vydechovaným objemem a FRC). Vyjadřuje, jak dlouho trvá vdechnutí plynu (v našem případě fyziologicky se vyskytujícího dusíku ve vzduchu) vdechnutím 100% kyslíku. U zdravých osob je tato hodnota v průměru 7 a je výrazně vyšší u plicních pacientů. Jsou vypočteny další parametry měření, které vypovídají o periferních dýchacích cestách proximálních k terminálním bronchiolům na jedné straně a přes distálnější azinové dýchací cesty na straně druhé.

Sportovní lékařské vyšetření: Pro vyloučení kontraindikací k ergometrii je na začátku vyšetření provedeno 12kanálové klidové EKG a klidové měření krevního tlaku (CombynTM Function & Spaces ECG, Academic Technologies). Po shromáždění antropometrických dat (výška, váha, BMI) se svalová hmota a tuková hmota určí multifrekvenčním měřením impedance v šesti tělesných segmentech (CombynTM Function & Spaces ECG, Academic Technologies). Funkce plic se měří pomocí malé spirometrie v klidu a po zátěži (Spirometer Oxycon Pro, Reiner). Pro stanovení kardiopulmonální výkonnosti se provádí ergospirometrie na kole (ergometr Excalibur Sport, firma Lode; spiroergometrická jednotka Oxycon Pro, firma Reiner) s postupným nárůstem stresu až do subjektivního vyčerpání. Vyhodnocení těchto údajů umožňuje kromě stanovení aerobního výkonu vyvodit závěry o systému omezujícím výkon (kardiovaskulární systém, plíce, svalstvo).

Analýza mikrobiomu/VOC po léčbě probiotikem: Po odběru vzorků pro analýzu mikrobiomu a VOC a provedení měření funkce plic a sportovního lékařského vyšetření účastníci studijní skupiny vezmou probiotikum (Omnibiotic 6, zakoupené od Allergosan Institute, doplněk stravy ) po dobu 3 měsíců. Bezprostředně poté a o další měsíc později se provedou měření plicního mikrobiomu a VOC v dechu.