Wirkung zirkulierender lncRNAs auf die diabetische periphere Neuropathie Typ 2

Screening von lncrnas, die die DPN-Entzündungsreaktion regulieren und an miR-146a binden

① Experimentelle Gruppierung Das Experiment wurde in eine T2DM-Gruppe und eine DPN-Gruppe unterteilt. Die T2DM-Gruppe war einfacher Typ-2-Diabetes ohne Komplikationen und andere Grunderkrankungen; Die DPN-Gruppe bestand aus einfachen T2DM-Patienten mit DPN. Die diagnostischen Kriterien für T2DM-Patienten entsprachen den chinesischen Leitlinien zur Prävention und Behandlung von Typ-2-Diabetes (Ausgabe 2017). Die Screening-Kriterien für T2DM-Patienten mit DPN sind wie folgt: 1. Klare Vorgeschichte von Typ-2-Diabetes mellitus. 2. Neuropathie bei oder nach der Diagnose von Diabetes. 3. Die klinischen Symptome und Anzeichen stimmten mit denen von DPN überein. Zu den klinischen Symptomen gehören: Taubheit oder Empfindung; Kribbeln oder Kribbeln; Schmerz; abnorme Empfindlichkeit oder Zärtlichkeit nach Berührung. 4. Untersuchung: A. anormales Temperaturgefühl; B. 10 g Nylonfadenuntersuchung, Fußgefühl vermindert oder verschwunden; C. abnormaler Vibrationssinn; D. Knöchelreflex verschwand; e. zwei oder mehr Elemente der Nervenleitgeschwindigkeit wurden verlangsamt (Elektromyographie oder sensorische Schwellenmessung). 5. Eine durch andere Krankheiten oder Medikamente verursachte Nervenschädigung wurde ausgeschlossen. Zwei der oben genannten fünf Punkte waren anormal, oder klinische Symptome + 1 Punkt waren anormal. ② Unter der Bedingung der vollständigen Einverständniserklärung wurden 3-ml-Plasmaproben aus der T2DM-Gruppe und der DPN-Gruppe entnommen, 4 Kopien in jeder Gruppe, und im Kühlschrank bei -80 °C gelagert. ③ Screening von lncrnas und mRNAs, die in zwei Gruppen von Proben unterschiedlich exprimiert werden, durch Gensequenzierung.

Gesamt-RNA wurde aus Gewebeproben extrahiert. Die Konzentration und Reinheit der RNA wurden von Nanodrop2000 nachgewiesen. Die Integrität der RNA wurde durch Agarose-Gelelektrophorese nachgewiesen, und der RIN-Wert wurde mit Agilent2100 bestimmt. Die Gesamt-RNA einer einzelnen Bibliothek war 2 UG, die Konzentration war mehr als 100 ng/μl, od260/280 war zwischen 1,8 ~ 2,2 und rRNA wurde entfernt. Unter Verwendung von Metallionen wurde die mRNA zufällig in kleine Fragmente von etwa 200 bp zerlegt. Unter der Wirkung von reverser Transkriptase wurde ein einzelner cDNA-Strang unter Verwendung von Zufallsprimern und unter Verwendung von mRNA als Matrize synthetisiert.

Der zweite cDNA-Strang wurde durch Substitution von dUTP für dTTP synthetisiert. Die Struktur der doppelsträngigen cDNA ist ein klebriges Ende. Die Endreparaturmischung wird hinzugefügt, um das flache Ende zu bilden, und dann wird eine a-Basis am 3'-Ende hinzugefügt, um die Y-förmige Verbindung zu verbinden. Der zweite cDNA-Strang wurde durch ein ung-Enzym verdaut, so dass nur der erste cDNA-Strang in der Bibliothek enthalten war. Dann wurde die Sequenzerplattform von Illumina für die Sequenzierung verwendet, um die ursprünglichen Sequenzierungsdaten zu erhalten. Die differentiell exprimierten lncrnas und mRNAs wurden durch Qualitätskontrolle und Sequenzalignment erhalten. ④ Die lncrnas mit einem Differenzmultiplikator ≥ 2 wurden erhalten, und die lncrnas, die mit Entzündungsfaktoren koexprimiert wurden, wurden durch Co-Expressionsanalyse bestimmt. ⑤ Verschiedene lncnras wurden aus Mircode- und Starbase-Datenbanken abgerufen, um lncnras kombiniert mit miR-146a zu erhalten.

In-vitro-Validierung von Kandidaten-lncnras:

① hohe Glucosekonzentration (200 mmol / L) induzierte Schädigung von Schwann-Zellen; ② Nachweis der Expression von lncnras-Kandidaten und miR-146a in Schwann-Zellen, die durch hohe Glukose induzierten, um lncnras mit hoher Expression zu erhalten; ③ Experiment mit doppeltem Luciferase-Reportergen, um die Kombination von Kandidaten-lncnras und miR-146a zu verifizieren und um Kandidaten-lncnras zu erhalten, die an miR-146a binden; ④ Konstruktionsverfahren: Der lncnras-Silencing-Vektor wurde verwendet, um lncnras-Kandidaten in durch hohe Glukose induzierte Schwann-Zellen zu transferieren; ⑤ Western Blot und Liquid Chip wurden verwendet, um die Spiegel von Entzündungsfaktoren (TNF-α, IL-1 β, IL-6 und IL-10) in Schwann-Zellen nachzuweisen; und ⑥ Korrelationsanalyse wurde verwendet, um die Inkremente zu bestimmen, die positiv mit Entzündungsfaktoren korrelierten.

Große Plasmaproben wurden verwendet, um die Korrelation zwischen Kandidaten-lncrnas und miR-146a und Entzündungsfaktoren zu verifizieren.

• die experimentelle Gruppierung war dieselbe wie zuvor; ② mit vollständiger Einverständniserklärung wurden 50 Plasmaproben von T2DM-Patienten und T2DM-Patienten mit DPN entnommen, jeweils 3 ml. ③ Kandidaten-lncrnas und miR-146a-Primer wurden entworfen und QRT-PCR wurde verwendet, um die Kandidaten-lncrnas und miR-146a nachzuweisen der beiden Gruppen wurden durch Flüssigchip-Technologie nachgewiesen; ⑤ lncrnas negativ korreliert mit miR-146a und positiv korreliert mit der Expression von Entzündungsfaktoren wurden durch Korrelationsanalyse bestimmt.

  4. Statistische Behandlung: SPSS 23.0-Software wurde für die statistische Analyse verwendet. Die Messdaten werden als Mittelwert ± Standardabweichung ausgedrückt. Eine Einweg-ANOVA oder ein nichtparametrischer Test wurde verwendet, um die Verteilungs- und Gruppierungseigenschaften zu analysieren. Die Pearson-Korrelationsanalyse wurde verwendet, um die Korrelation von Messdaten zu analysieren. Mit P < 0,05 war der Unterschied statistisch signifikant.

  5. Technischer Weg Diese Studie ist hauptsächlich in drei Teile gegliedert. Erstens werden lncrnas gescreent, die die DPN-Entzündungsreaktion regulieren und an miR-146a binden; auf dieser Grundlage werden Kandidaten-lncnras durch In-vitro-Validierung erhalten; Schließlich werden Incnras mit molekularer Markerfunktion an großen Probenplasmaproben verifiziert.

  6. Technische Schwierigkeiten In dieser Studie verwendeten wir Gensequenzierungstechnologie, um die differentielle Expression von lncrnas und mRNAs im Plasma von T2DM-Patienten und DPN-Patienten nachzuweisen, kombiniert mit Bioinformatik-Technologie, um lncrnas im Zusammenhang mit Entzündungen und Bindung an miR-146a zu screenen. Ziel des Screenings auf miR-146a-bindende Proteine ​​im Zusammenhang mit Entzündungs-Lncrnas sind die technischen Schwierigkeiten in dieser Studie.