Wpływ krążących lncRNA na obwodową neuropatię cukrzycową typu 2

Badania przesiewowe lncrnas, które regulują odpowiedź zapalną DPN i wiążą się z miR-146a

① Grupowanie eksperymentalne Eksperyment podzielono na grupę T2DM i grupę DPN. Grupę T2DM stanowiła prosta cukrzyca typu 2, bez powikłań i innych podstawowych chorób; Grupę DPN stanowili zwykli pacjenci z T2DM z DPN. Kryteria diagnostyczne dla chorych na T2DM były zgodne z chińskimi wytycznymi dotyczącymi profilaktyki i leczenia cukrzycy typu 2 (edycja 2017). Kryteria przesiewowe dla pacjentów z T2DM i DPN są następujące: 1. Wyraźna historia cukrzycy typu 2. 2. Neuropatia w momencie lub po rozpoznaniu cukrzycy. 3. Kliniczne objawy podmiotowe i przedmiotowe były zgodne z objawami DPN. Objawy kliniczne obejmują: drętwienie lub czucie; mrowienie lub mrowienie; ból; nienormalna wrażliwość lub tkliwość po dotknięciu. 4. Badanie: A. nieprawidłowy odczyt temperatury; B. Badanie nicią nylonową 10 g, czucie w stopie zmniejszyło się lub zniknęło; C. nieprawidłowe wyczucie wibracji; D. zanik odruchu skokowego; mi. dwa lub więcej elementów prędkości przewodzenia nerwowego zostało spowolnionych (elektromiografia lub pomiar progu czuciowego). 5. Wykluczono uszkodzenie nerwów spowodowane innymi chorobami lub lekami. Dwie z powyższych pięciu pozycji były nieprawidłowe lub objawy kliniczne + 1 pozycja były nieprawidłowe. ② Pod warunkiem pełnej świadomej zgody pobrano 3 ml próbki osocza od grupy T2DM i grupy DPN, 4 kopie w każdej grupie i przechowywano w lodówce w temperaturze -80 ℃. ③ Przeszukiwanie lncrnas i mRNA ulegających różnej ekspresji w dwóch grupach próbek poprzez sekwencjonowanie genów.

Całkowity RNA ekstrahowano z próbek tkanek. Stężenie i czystość RNA zostały wykryte przez Nanodrop2000. Integralność RNA wykrywano za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym, a wartość RIN określano za pomocą Agilent2100. Całkowity RNA pojedynczej biblioteki wynosił 2 UG, stężenie było większe niż 100 ng/μl, od260/280 wynosiło między 1,8 ~ 2,2, a rRNA usunięto. Za pomocą jonów metali mRNA zostało losowo podzielone na małe fragmenty o wielkości około 200 pz. Pod działaniem odwrotnej transkryptazy zsyntetyzowano pojedynczą nić cDNA, stosując losowe startery i stosując mRNA jako matrycę.

Drugą nić cDNA zsyntetyzowano przez zastąpienie dUTP dTTP. Struktura dwuniciowego cDNA jest lepkim końcem. Mieszanka do naprawy końców jest dodawana w celu wykonania płaskiego końca, a następnie podstawa jest dodawana na końcu 3 'w celu połączenia złącza w kształcie litery Y. Drugą nić cDNA strawiono enzymem tak, że tylko pierwsza nić cDNA była zawarta w bibliotece. Następnie do sekwencjonowania wykorzystano platformę sekwencera Illumina w celu uzyskania oryginalnych danych sekwencjonowania. Różnie eksprymowane lncrna i mRNA otrzymano przez kontrolę jakości i dopasowanie sekwencji. ④ Uzyskano lncrnas z wielokrotnością różnic ≥ 2, a lncrnas koeksprymowane z czynnikami zapalnymi określono za pomocą analizy koekspresji. ⑤ Różne lncnras zostały pobrane z baz danych mircode i Starbase w celu uzyskania lncnras połączonych z miR-146a.

Walidacja in vitro kandydujących lncnras:

① wysokie stężenie glukozy (200 mmol / L) wywołane uszkodzeniem komórek Schwanna; ② wykrywanie ekspresji kandydujących lncnras i miR-146a w komórkach Schwanna indukowanych wysokim poziomem glukozy w celu uzyskania lncnras o wysokiej ekspresji; ③ eksperyment z podwójnym genem reporterowym lucyferazy w celu zweryfikowania kombinacji kandydujących lncnras i miR-146a oraz uzyskania kandydującego wiązania lncnras z miR-146a; ④ metody konstrukcji: wektor wyciszający lncnras został użyty do przeniesienia kandydujących lncnras do komórek Schwanna indukowanych wysokim poziomem glukozy; ⑤ Do wykrywania poziomów czynników zapalnych (TNF - α, IL-1 β, IL-6 i IL-10) w komórkach Schwanna zastosowano Western blot i płynny chip; i ⑥ analiza korelacji została wykorzystana do określenia lncrnas dodatnio skorelowanych z czynnikami zapalnymi.

Duże próbki osocza wykorzystano do zweryfikowania korelacji między kandydującymi lncrnas i miR-146a a czynnikami zapalnymi.

• grupowanie eksperymentalne było takie samo jak poprzednio; ② za pełną świadomą zgodą pobrano 50 próbek osocza od pacjentów z T2DM i pacjentów z T2DM z DPN, każda po 3 ml. ③ Zaprojektowano startery kandydujące lncrnas i miR-146a oraz zastosowano QRT PCR do wykrycia kandydujących lncrnas i miR-146a Poziomy czynników zapalnych (TNF - α, IL-1 β, IL-6 i IL-10) w osoczu z tych dwóch grup wykryto za pomocą technologii ciekłych chipów; ⑤ Incrna ujemnie skorelowane z miR-146a i dodatnio skorelowane z ekspresją czynników zapalnych określono za pomocą analizy korelacji.

  4. Leczenie statystyczne: Do analizy statystycznej zastosowano oprogramowanie SPSS 23.0. Dane pomiarowe wyrażono jako średnią ± SD Do analizy rozkładu i charakterystyki grupowania zastosowano jednokierunkową ANOVA lub test nieparametryczny. Do analizy korelacji danych pomiarowych wykorzystano analizę korelacji Pearsona. Przy p < 0,05 różnica była istotna statystycznie.

  5. Ścieżka techniczna Niniejsze opracowanie zasadniczo dzieli się na trzy części. Najpierw przeszukiwane są lncrnas, które regulują odpowiedź zapalną DPN i wiążą się z miR-146a; na tej podstawie kandydujące lncnras uzyskuje się poprzez walidację in vitro; wreszcie, lncnras z funkcją markera molekularnego są weryfikowane na dużych próbkach osocza.

  6. Trudności techniczne W tym badaniu wykorzystaliśmy technologię sekwencjonowania genów do wykrywania zróżnicowanej ekspresji lncrnas i mRNA w osoczu pacjentów z T2DM i pacjentów z DPN, w połączeniu z technologią bioinformatyczną do przeszukiwania lncrnas związanych ze stanem zapalnym i wiązania się z miR-146a. Celem badania przesiewowego białek wiążących miR-146a związanych z zapaleniem. Trudności techniczne w tym badaniu stanowią trudności.