Effekt av cirkulerande lncRNA på typ 2 diabetisk perifer neuropati

Screening av lncrnas som reglerar DPN-inflammatorisk respons och binder till miR-146a

① Experimentell gruppering Experimentet delades upp i T2DM-grupp och DPN-grupp. T2DM-gruppen var enkel typ 2-diabetes, utan komplikationer och andra grundläggande sjukdomar; DPN-gruppen var enkla T2DM-patienter med DPN. De diagnostiska kriterierna för T2DM-patienter var i enlighet med de kinesiska riktlinjerna för förebyggande och behandling av typ 2-diabetes (2017 Edition). Screeningskriterierna för T2DM-patienter med DPN är följande: 1. Tydlig historia av typ 2-diabetes mellitus. 2. Neuropati vid eller efter diagnosen diabetes. 3. De kliniska symtomen och tecknen överensstämde med de för DPN. Kliniska symtom inkluderar: domningar eller känsla; stickningar eller stickningar; smärta; onormal känslighet eller ömhet efter beröring. 4. Undersökning: A. onormal temperaturavkänning; B. 10 g nylontrådsundersökning, fotkänslan minskade eller försvann; C. onormal vibrationskänsla; D. fotledsreflex försvann; e. två eller flera objekt av nervledningshastigheten bromsades ned (elektromyografi eller sensorisk tröskelmätning). 5. Nervskada orsakad av andra sjukdomar eller läkemedel uteslöts. Två av de fem punkterna ovan var onormala eller kliniska symtom + 1 punkt var onormala. ② Under villkoret av fullt informerat samtycke samlades 3 ml plasmaprover från T2DM-gruppen och DPN-gruppen, 4 kopior i varje grupp och förvarades i kylskåp vid -80 ℃. ③ Screening av lncrnas och mRNA differentiellt uttryckta i två grupper av prover genom gensekvensering.

Totalt RNA extraherades från vävnadsprover. Koncentrationen och renheten av RNA detekterades av Nanodrop2000. Integriteten av RNA detekterades genom agarosgelelektrofores och RIN-värdet bestämdes av Agilent2100. Det totala RNA:t i ett enda bibliotek var 2 UG, koncentrationen var mer än 100 ng/μL, od260/280 var mellan 1,8 ~ 2,2 och rRNA avlägsnades. Med användning av metalljoner bröts mRNA:t slumpmässigt i små fragment på cirka 200 bp. Under verkan av omvänt transkriptas syntetiserades en enkel sträng av cDNA genom att använda slumpmässiga primrar och använda mRNA som mall.

Den andra strängen av cDNA syntetiserades genom att dTTP ersatte dUTP. Strukturen hos det dubbelsträngade cDNA:t är en klibbig ände. Ändreparationsblandningen läggs till för att utgöra den platta änden, och sedan läggs en bas till i 3'-änden för att ansluta den Y-formade förbindelsen. Den andra strängen av cDNA digererades av ung enzym så att endast den första strängen av cDNA fanns i biblioteket. Sedan användes Illumina sequencer-plattformen för sekvensering för att erhålla den ursprungliga sekvenseringsdatan. De differentiellt uttryckta lncrna och mRNA erhölls genom kvalitetskontroll och sekvensanpassning. ④ Incrnas med skillnadsmultipel ≥ 2 erhölls, och lncrnas co-uttryckt med inflammatoriska faktorer bestämdes genom co-expressionsanalys. ⑤ Olika lncnras hämtades från mircode- och Starbase-databaser för att få lncnras kombinerade med miR-146a.

In vitro-validering av kandidatincnras:

① hög koncentration av glukos (200 mmol / L) inducerad skada på Schwann-celler; ② detektion av uttrycket av kandidat-lncnras och miR-146a i högglukosinducerade Schwann-celler för att erhålla lncnras med högt uttryck; ③ dubbelluciferasreportergenexperiment för att verifiera kombinationen av kandidat-lncnras och miR-146a, och erhålla kandidat-lncnras som binder till miR-146a; ④ konstruktionsmetoder: lncnras tystande vektor användes för att överföra kandidat-lncnras till högglukosinducerade Schwann-celler; ⑤ Western blot och flytande chip användes för att detektera nivåerna av inflammatoriska faktorer (TNF - α, IL-1 β, IL-6 och IL-10) i Schwann-celler; och ⑥ korrelationsanalys användes för att bestämma lncrnas positivt korrelerade med inflammatoriska faktorer.

Stora plasmaprover användes för att verifiera korrelationen mellan kandidat-lncrnas och miR-146a och inflammatoriska faktorer.

• den experimentella grupperingen var densamma som tidigare; ② med fullt informerat samtycke samlades 50 plasmaprover från T2DM-patienter och T2DM-patienter med DPN, vardera 3 ml vardera. ③ kandidat-lncrnas och miR-146a-primrar designades och QRT PCR användes för att detektera kandidat-lncrnas och miR-146a Nivåerna av inflammatoriska faktorer (TNF - α, IL-1 β, IL-6 och IL-10) i plasman av de två grupperna upptäcktes med vätskechipteknologi; ⑤ lncrnas negativt korrelerade med miR-146a och positivt korrelerade med uttrycket av inflammatoriska faktorer bestämdes genom korrelationsanalys.

  4. Statistisk behandling: SPSS 23.0 programvara användes för statistisk analys. Mätdata uttrycks som medelvärde ± SD Envägs ANOVA eller icke-parametriskt test användes för att analysera fördelnings- och grupperingsegenskaperna. Pearson korrelationsanalys användes för att analysera korrelationen av mätdata. Med P < 0,05 var skillnaden statistiskt signifikant.

  5. Teknisk väg denna studie är huvudsakligen uppdelad i tre delar. För det första screenas lncrnas som reglerar DPN-inflammatorisk respons och binder till miR-146a; på denna grund erhålls kandidatincnras genom in vitro-validering; slutligen verifieras lncnras med molekylär markörfunktion på stora plasmaprover.

  6. Tekniska svårigheter I denna studie använde vi gensekvenseringsteknik för att detektera det differentiella uttrycket av lncrnas och mRNAs i plasma från T2DM-patienter och DPN-patienter, kombinerat med bioinformatikteknologi för att screena lncrnas relaterade till inflammation och binda till miR-146a. Mål att screena för miR-146a-bindande proteiner associerade med inflammation Lncrnas är de tekniska svårigheterna i denna studie.