A mikrobiológiai környezet összefüggése a vastag- és végbélbetegségben

Projekt leírása Általános hipotézis: A vastagbél mikrobiális környezete korrelál a bélpatológiával, és releváns a vastagbélbetegség kialakulásában és progressziójában.

Kutatási kérdések és eredmények:

Az 1. fázisban (1. év, hipotézisgeneráló fázis) a specifikus baktériumok és a következő betegségek közötti összefüggést vizsgálják: vastag- és végbélbetegség (kolorektális rák/polipok, adenomák (rák előtti elváltozások), gyulladásos bélbetegség (IBD) és divertikulózis) .

Kutatási kérdések:

1. A bélnyálkahártya mikrokörnyezete az adenomák/kolorektális adenokarcinómával, IBD-vel és a bakteriális készlettel kolonizált divertikulózissal járó szövetben és környékén eltér az egészséges nyálkahártyától?
2. Befolyásolják-e az életkor, a nem és az élet/étkezési szokások a különböző típusú baktériumok összetételét?

A 2. fázisban (2-3. évfolyam) célunk olyan specifikus bakteriális biomarkerek azonosítása, amelyek szűrési eszközként használhatók, és megalapozzuk a vastag- és végbélbetegségek jövőbeni új kezelési módjait.

Elsődleges kutatási kérdések:

1. Összefüggenek-e specifikus baktériumkészletek az adenoma és a vastagbélrák korai kialakulásával?
2. Használhatók-e ezek a baktériumok széklet biomarkerként egy vastagbélrák szűrőprogramjában, vagy szerológiai biomarkerekkel azonosíthatók?
3. A specifikus baktériumok azonosítása vezethet-e további vizsgálatokhoz a vastag- és végbélrák kialakulásának és növekedésének lehetséges geneziséről?

Másodlagos kutatási kérdések:

1. Speciális baktériumkészletek társulnak-e az IBD-hez és a divertikulózishoz, és ezek felhasználhatók-e bélsár vagy szerológiai biomarkerként a betegségekre?
2. Csökkentheti-e ezen baktériumok vagy metabolitjaik kezelése az IBD-vel vagy a divertikulitisszel (divertikuláris gyulladás) kapcsolatos megbetegedések előfordulását?

Vizsgálati populáció és végrehajtás

1. fázis: (2017) -2018. Egy év alatt a Danderyd's Hospitalban kolonoszkópiára tervezett összes beteget (mintanagyság = 2500 beteg) egymást követően meghívják, hogy vegyen részt a vizsgálatban, és adja meg a beleegyezését.

Kizárási kritériumok: Vérzés kockázata (nemzetközi normalizált arány (INR) > 1,6), súlyos demencia vagy képtelenség az információk megértésére és a részvétellel kapcsolatos megalapozott döntés meghozatalára.

Azok a betegek, akik hozzájárulnak a részvételhez, levélben kapnak tájékoztató levelet a vizsgálatról (2-3 héttel a kolonoszkópia előtt). Ezen kívül minden beteg telefonhívást is kap a vizsgálatra emlékeztetőül. A bél előkészítése előtt a betegeket arra kérik, hogy hagyjanak bélsármintát, amelyet tenyésztésre mentenek. A vizsgálatban résztvevőket arra is felkérik, hogy töltsenek ki egy validált kérdőívet a kórtörténetről, a korábbi betegségekről, az étrendről, az életmódbeli szokásokról, a korábbi kolonoszkópiáról és az antibiotikum-kezelésről. Közvetlenül a kolonoszkópiás vizsgálat előtt négy vérmintát vesznek: kettőt a HbA1c, a hemoglobin és a C-reaktív fehérje (CRP) analíziséhez, kettőt pedig a kórház biobank-robotjában történő tároláshoz a biomarkerek későbbi elemzéséhez.

A kolonoszkópia során a rutin diagnosztikai szövetmintákon kívül szövetmintákat vesznek a vastagbél nyálkahártyájából:

1. Két biopsziát (egyet a DNS-szekvenáláshoz, egyet a tenyésztéshez) vesznek a vastagbél nyálkahártyájának egészséges részéből (lehetőleg a vastagbél első részéből) minden betegnél.
2. Négy biopszia, kettő (DNS + tenyészet) patológiás vastagbélnyálkahártyából (polip (adenómák) / vastagbélrák / IBD/divertikulózis) és kettő (DNS + tenyészet) a patológiás nyálkahártya közeli területén.

2. fázis: 2018-2020.

1. Biológiailag fontos baktériumok és metabolitjaik kimutatása és vizsgálata (metagenomika és metabolomika (metabolitokat érintő kémiai folyamatok tanulmányozása)) történik majd a konkrét bakteriális génekkel kapcsolatos információk érdekében.
2. Ezeket az adatokat azután statisztikailag elemzik a különböző kolorektális állapotokkal való összefüggések szempontjából, az orvosi feljegyzésekben és a páciens kérdőívében található zavaró tényezők és expozíciók figyelembevételével (lásd alább). Ezek az elemzések fontos, újszerű információkkal szolgálnak számunkra a rák és a gyulladás kialakulásának szempontjából lényeges patogén mechanizmusokról.
3. A vastagbélbetegséggel kapcsolatos specifikus bakteriális összetételek ezen várható eredményei alapján megkezdődhet a specifikus betegségmechanizmusok elemzése.
4. A betegség-specifikus bakteriális készítmények vastagbélbetegség klinikai markereként való alkalmazásának lehetőségeit is feltárják. Ebben az alvizsgálatban megvizsgáljuk a nyálkahártya mikrobiota és a székletben lévő mikrobiota közötti összefüggést. Így az összes beteg székletmintáit felhasználják annak felderítésére, hogy ezek megfelelnek-e a kóros és egészséges bélterületről vett vastagbélnyálkahártya bakteriális összetételének. Ezenkívül a szerológiai biomarkereket a kóros nyálkahártyából származó nyálkahártya-minták specifikus bakteriális összetételével kapcsolatban minden vizsgálati betegnél megvizsgálják.

Minták és elemzés A mintákat először a Danderyd Hospital biobankban tárolják és rögzítik, majd DNS-elemzésre küldik a Science for Life laboratóriumába, a Karolinska Institutetba. A DNS-elemzés (elsődleges változók) a 16S rRNS gén masszív párhuzamos szekvenálására vonatkozik, amely információt ad a mintában lévő baktériumok összetételéről és a baktériumok relatív mennyiségéről egészen a génszintig. Az eredményeket diverzitási indexként (Shannon diverzitási index vagy alfa diverzitás ugyanazon a mintán belül) és a QIIME szoftveren alapuló Unifrac elemzésként mutatjuk be. Az utóbbi elemzés a minták közötti bakteriális összetételbeli különbségeket mutatja – az úgynevezett béta-diverzitást. A kiválasztott mintákon a 16S szekvenálás mellett úgynevezett metagenomikus szekvenálást is végeznek majd – ezzel a vizsgálattal a konkrét bakteriális géntartalomról is tájékozódhatunk, és így a rák kialakulását is magában foglaló patogén mechanizmusokról szerezhetünk ismereteket. Az étrendi és életmódbeli szokások validált kérdőívét a mikrobiális környezet (a laboratóriumi elemzésben függő változó) összefüggésében elemezzük.