Związek między środowiskiem mikrobiologicznym w chorobie okrężnicy i jelita grubego

Opis projektu Hipoteza ogólna: Mikrobiologiczne środowisko okrężnicy koreluje z patologią jelit i ma znaczenie dla rozwoju i postępu choroby jelita grubego.

Pytania badawcze i wyniki:

W fazie 1 (rok 1, faza generowania hipotez) zbadany zostanie związek między określonymi bakteriami a następującymi chorobami: choroba jelita grubego (rak jelita grubego / polipy, gruczolaki (zmiany przednowotworowe), choroba zapalna jelit (IBD) i uchyłkowatość) .

Pytania badawcze:

1. Czy mikrośrodowisko błony śluzowej jelita w tkance i wokół niej z gruczolakorakiem/gruczolakorakiem jelita grubego, nieswoistym zapaleniem jelit i uchyłkowatością jest skolonizowane zestawem bakteryjnym innym niż zdrowa błona śluzowa?
2. Czy wiek, płeć i styl życia/nawyki żywieniowe wpływają na różne rodzaje składu bakteryjnego?

W fazie 2 (rok 2-3) dążymy do zidentyfikowania określonych biomarkerów bakteryjnych, które można wykorzystać jako narzędzia przesiewowe i położyć podwaliny pod przyszłe nowe metody leczenia chorób jelita grubego.

Podstawowe pytania badawcze:

1. Czy określone zestawy bakterii są związane z wczesnym powstawaniem gruczolaka i raka jelita grubego?
2. Czy bakterie te mogą być stosowane jako biomarkery kału w programie badań przesiewowych raka jelita grubego lub mogą być identyfikowane za pomocą biomarkerów serologicznych?
3. Czy identyfikacja konkretnych bakterii może prowadzić do dalszych badań nad możliwą genezą powstania i rozwoju raka jelita grubego?

Dodatkowe pytania badawcze:

1. Czy określone grupy bakteryjne są związane z IBD i uchyłkowatością i czy można je wykorzystać jako biomarkery kałowe lub serologiczne choroby?
2. Czy leczenie tych bakterii lub ich metabolitów może zmniejszyć częstość występowania zachorowań związanych z nieswoistym zapaleniem jelit lub zapaleniem uchyłków?

Badana populacja i wdrożenie

Faza 1: (2017) -2018. W ciągu roku wszyscy pacjenci zakwalifikowani do kolonoskopii w Danderyd's Hospital (wielkość próby = 2500 pacjentów) będą kolejno zapraszani do udziału w badaniu i wyrażenia świadomej zgody.

Kryteria wykluczenia: Ryzyko krwawienia (zdefiniowane jako międzynarodowy współczynnik znormalizowany (INR) > 1,6), ciężka demencja lub niezdolność do zrozumienia informacji i podjęcia świadomej decyzji o uczestnictwie.

Pacjenci, którzy wyrażą zgodę na udział, otrzymają pocztą list informacyjny o badaniu (2-3 tygodnie przed kolonoskopią). Ponadto wszyscy pacjenci otrzymają również telefon przypominający o badaniu. Przed przygotowaniem jelita pacjent zostanie poproszony o pozostawienie próbki kału, która zostanie zachowana do posiewu. Uczestnicy badania zostaną również poproszeni o wypełnienie zweryfikowanego kwestionariusza dotyczącego historii choroby, przebytych chorób, diety, nawyków związanych ze stylem życia, wcześniejszych kolonoskopii i leczenia antybiotykami. Bezpośrednio przed badaniem kolonoskopowym zostaną pobrane cztery próbki krwi: dwie do analizy HbA1c, hemoglobiny i białka C-reaktywnego (CRP) oraz dwie do przechowywania w szpitalnym biobanku robota do późniejszej analizy biomarkerów.

Podczas kolonoskopii oprócz rutynowych próbek tkanek diagnostycznych zostaną pobrane próbki tkanek z błony śluzowej okrężnicy:

1. U wszystkich pacjentów zostaną pobrane dwie biopsje (jedna do sekwencjonowania DNA, druga do hodowli) ze zdrowej części błony śluzowej okrężnicy (najlepiej w pierwszej części okrężnicy).
2. Cztery biopsje, dwie (DNA + kultura) z patologicznej błony śluzowej okrężnicy (polip (gruczolaki) / rak jelita grubego / IBD / uchyłkowatość) i dwie (DNA + kultura) w pobliskim obszarze patologicznej błony śluzowej.

Faza 2: 2018-2020.

1. Prowadzone będzie wykrywanie i badanie biologicznie ważnych bakterii i ich metabolitów (metagenomika i metabolomika (badania procesów chemicznych z udziałem metabolitów)) w celu uzyskania informacji o konkretnych genach bakteryjnych.
2. Dane te zostaną następnie poddane analizie statystycznej pod kątem wszelkich powiązań z różnymi stanami jelita grubego, z uwzględnieniem zakłóceń i ekspozycji dostępnych w dokumentacji medycznej i kwestionariuszu pacjenta (patrz poniżej). Analizy te dostarczą nam ważnych nowych informacji na temat patogennych mechanizmów mających znaczenie dla rozwoju raka i stanu zapalnego.
3. W oparciu o te oczekiwane ustalenia dotyczące określonego składu bakteryjnego w odniesieniu do choroby okrężnicy, można rozpocząć analizę określonych mechanizmów chorobowych.
4. Zbadane zostaną również możliwości zastosowania kompozycji bakteryjnych specyficznych dla danej choroby jako klinicznego markera choroby okrężnicy. Podczas tego badania szczegółowego przyjrzymy się powiązaniom między mikrobiomem błony śluzowej a mikrobiomem kału. Zatem próbki kału od wszystkich pacjentów zostaną wykorzystane do zbadania, czy odpowiadają one składowi bakteryjnemu błony śluzowej okrężnicy pobranej z patologicznego i zdrowego obszaru jelita. Ponadto badane będą biomarkery serologiczne w odniesieniu do określonego składu bakteryjnego w próbkach śluzówki z patologicznej błony śluzowej u wszystkich badanych pacjentów.

Próbki i analiza Próbki są najpierw przechowywane i rejestrowane w biobanku szpitala Danderyd, a następnie wysyłane do analizy DNA w laboratorium Science for Life, Karolinska Institutet. Analiza DNA (zmienne pierwotne) dotyczy masowego sekwencjonowania równoległego genu 16S rRNA, które dostarcza informacji o składzie bakterii w próbce i względnej ilości bakterii aż do poziomu genu. Wyniki przedstawiono jako wskaźnik różnorodności (wskaźnik różnorodności Shannona lub różnorodność alfa w obrębie tej samej próbki) oraz analizę Unifrac opartą na oprogramowaniu QIIME. Ta ostatnia analiza pokazuje różnice w składzie bakteryjnym pomiędzy próbkami – tzw. różnorodność beta. Oprócz sekwencjonowania 16S, na wybranych próbkach zostanie przeprowadzone tzw. sekwencjonowanie metagenomiczne - za pomocą tego testu można również uzyskać informacje o zawartości konkretnych genów bakteryjnych, a tym samym zdobyć wiedzę na temat mechanizmów patogenetycznych mających znaczenie m.in. dla rozwoju raka. Zwalidowany kwestionariusz nawyków żywieniowych i stylu życia zostanie przeanalizowany w odniesieniu do środowiska mikrobiologicznego (zmienna zależna w tej analizie laboratoryjnej).