生後1～6か月の乳児の経腸スレオニン必要量を決定するための生理学的研究 (INFORALTHR)

序章

スレオニンは必須のAAであり、食事源から摂取する必要があります。 これは腸内でのムチンの生成に重要であり（Law、Bertolo et al. 2007）、コラーゲン、エラスチン、歯のエナメル質の形成に大きく寄与しています（Kramsch、Franzblau et al. 1971、Robinson、Lowe et al. 1975）。 2005 年の主要栄養素の食事摂取基準 (DRI) において、医学食品栄養委員会によって提案された乳児のスレオニンの現在の適切な摂取量 (AI) は、決定的な経験データが不足しているため、要因アプローチに基づいています。 乳児のアミノ酸 (AA) 要件の決定につながる研究では窒素分析技術が使用され、20 年以上前に実施されました (Snyderman、Norton et al. 1959)。 方法論の進歩により、より正確な技術で人間のAA要件を決定することが可能になりました(Zello, Wykes et al. 1995)。 しかし、より新しい安定同位体法を使用した乳児（生後1～6カ月）のスレオニン必要量に関する研究は報告されていない。

アミノ酸要件を正確に決定するには、アミノ酸摂取量の範囲を提供する必要があります。 倫理的な理由から、乳児に非常に低濃度または高濃度のアミノ酸濃度の食事を長期間にわたって与えることはできません。 低侵襲性の IAAO 法は、当初私たちの研究室で成人を対象に開発され (Zello, Pencharz et al. 1993)、現在はアミノ酸要件を決定するために国際的に使用されています (Huang, Hogewind-Schoonenboom et al. 2011) が、この問題を克服しています。 IAAO 法は実施に 24 時間未満かかり、非経口栄養の新生児、経腸栄養の新生児、小児および成人に安全に使用されています。

私たちの研究室は、子豚におけるスレオニンの経腸必要量を測定しました (Bertolo, Chen et al. 1998) それは 0.42g/kg/d でした。 我々はこのデータから推定することができ、新生児の経腸必要量は 84 mg/kg/d になると提案します。 この研究では、生後 1 ～ 6 か月の乳児の経腸必要量を決定し、生後 1 か月を過ぎると成長が鈍化しタンパク質必要量が減少するため、乳児の経腸必要量は DRI の AI である 73 mg と同様になると予測します。 /kg/日。 したがって、この研究の目的は、IAAO 法を使用して生後 1 ～ 6 か月の乳児の経腸トレオニン必要量を決定することです。

対象と方法

被験者: 合計 18 件の研究が実施され、参加者は 18 件のスレオニン摂取試験のうち 1 件に無作為に割り当てられます。 生後1カ月から6カ月の乳児は、カナダのトロントにある病児病院（SickKids）の手術後の入院患者から募集される。 参加者は登録後に複数の研究摂取に参加する資格がある場合があるため、2 回目のスレオニン摂取にランダムに割り当てられます。 すべての研究手順と同意書は、SickKids の研究倫理委員会の承認を得ます。 乳児を研究に登録する許可は主治医から得られ、書面によるインフォームドコンセントは一方または両方の両親/保護者から得られます。 患者の募集は2015年12月に開始される予定です。 この研究はclin​​icaltrials.govに登録されています #NCT02364843。

乳児は、生後1か月から6か月で、在胎週数32週から43週の間に生まれ、正常な血液値とバイタルサインによって臨床的に安定していると判断され、次のような入院患者である場合に研究に含まれます。経鼻胃（NG-）、空腸（NJ-またはJ-）、または胃（G-）栄養チューブを介して栄養を補給されている場合。 酸素の補給を受けている場合、人工呼吸器を使用している場合、タンパク質およびAAの代謝に影響を与える可能性のある内分泌異常または遺伝的異常がある場合、またはタンパク質およびAAの代謝に影響を与える可能性のある薬剤を投与されている乳児は除外されます（例: コルチコステロイド療法）。

実験計画と食事の研究

この研究デザインは低侵襲性のIAAOデザインであり、AAは体内に貯蔵されないため、タンパク質合成への使用と比較した食事の必須AAの摂取量が、それらが酸化されるかタンパク質に組み込まれるかを決定するという概念に基づいている。 1 つの必須 AA の摂取が制限されると、他の必須 AA が過剰になり、前述したようにタンパク質に組み込むことができないため酸化されます (Zello, Pencharz et al. 1993)。 各研究は、研究日の24～48時間前に乳児の飼料からのタンパク質および非タンパク質エネルギーの適切な経腸摂取が行われていることを乳児の臨床栄養士から確認した後、18～24時間かけて行われます。 研究の 1 日 (期間は 24 時間未満、図 1 を参照) に、乳児は既知の量の炭水化物、脂肪を供給する市販の無タンパク質経腸ミルク (Pro-Phree) から作られたミルクを受け取ります。 、ミネラル、微量元素、ビタミンが乳児に適しており、これにAA混合物が追加されます。 アミノ酸は、mg・kg-1・d-1 で次のように母乳のパターンに追加されます: Lys 207、Met 48、Leu 288、Ile 165、Val 165、Phe 126、Try 51、His 63、Tyr 156 、Arg 69、Pro 240、Cys 51、Gly 69、Ala 114、Ser 150、Asp 270、Glu 534 (WHO 2007)。 各乳児には研究ごとに異なるトレオニン摂取量が与えられ、18 人の乳児に対する 18 回の摂取量は 15 ～ 130 mg·kg-1·d-1 の連続値になります。 スレオニンの摂取量が変化すると、必須のAAであるアラニンの摂取量を変化させることにより、処方は等窒素生成として維持されます。 アミノ酸混合物は 0.22 μ フィルターに通され、無菌で病原体が含まれていないことが確認されます。 これは、市販の粉ミルクでは行われない追加の安全手順ですが、非経口栄養を与えられた乳児のスレオニンとリジンの必要量を研究する際に当社の非経口溶液で行われました（Chapman 2009、2010）。 AA混合物と商業的に調製されたPro-Phree製剤の混合は、臨床製剤調製のための標準操作手順（SOP）ガイドラインに基づいて病院の製剤室で行われます。 乳児は、臨床栄養士の指示に従って、18～24時間の研究期間にわたって、栄養チューブを介して、または経管栄養と経口栄養の組み合わせで研究用配合乳を摂取します。

米国メイン州のケンブリッジアイソトープ研究所（CIL）が製造した研究グレードの安定同位体トレーサーは、さまざまなスレオニン摂取量に応じた酸化またはタンパク質の沈着を測定するために使用されます。 安定同位体はアミノ酸のL-[1-13C]フェニルアラニンであり、乳児の飼料とともに15μ・kg-1/h-1の用量で投与される。 この安定同位体は、アミノ酸フェニルアラニンの総割合の 1% としてすべての人間の体内に存在しており、安定同位体自体は、トロントの病児病院で実施されたこれまでの 4 つの研究で乳児に静脈内投与された場合、無害で成功裏に使用されました。カナダ (Roberts 2001; Courtney Martin 2008; Chapman 2009、2010)。

私たちは、乳児非経口研究で決定されたベースライン値を超える1-13CPフェニルアラニン安定同位体で乳児が定常状態に達するのに十分な時間を提供する研究プロトコルを使用しています（Chapman 2009、2010）。 最初の 2 つの研究は、フェニルアラニン安定同位体のみを使用して実施します。 分析により、1-13CPフェニルアラニン安定同位体のベースラインレベルと定常状態レベルの間に十分な差が見られないことが判明した場合は、14μmol kgの13C-重炭酸ナトリウム（NaH13CO2）を1回投与します。 1 NG/G チューブによって投与され、乳児に自然に存在する 1-13CP フェニルアラニンと粉ミルクで投与する量との違いを確認できるようになります。 私たちは重炭酸塩同位体を使用する必要があるとは考えていませんが、その使用が必要になった場合の承認のためにプロトコルに追加しました。 これは、乳児のアミノ酸必要量も研究しているオランダの科学者グループによって日常的に使用されていますが、その投与に関するいかなる問題も報告していません (Hogewind-Schoonenboom 2014)

安定同位体トレーサーには「研究用途のみ」とラベルが貼られており、あらゆる年齢の人への使用が許容されており、同位体製造会社によって確認され、化学純度、存在する場合にはその存在を検査した分析証明書が提供されます。重金属（百万分の一）および発熱物質を含む微生物検査。 両方の同位体は、臨床食事と同じ SOP ガイドラインに基づいて、研究用処方の調製時に病院の食事キッチンで調製されます。

サンプルの収集と分析

研究の食事に対する乳児の反応の変化を調べるために、呼気サンプルと尿が収集されます。 研究食の導入前に、3 つのベースライン呼気および尿サンプルが収集されます。 研究グレードの安定同位体標識トレーサーの導入後 12 ～ 18 時間後に、1 時間ごとに 4 つのプラトー呼気および尿サンプルが収集されます。 呼気サンプルは、熱量計と呼ばれる臨床検査装置と同様の設計および用途の二酸化炭素分析カートを使用して収集されます。 どちらの装置も通気フード システムを使用しており、その下で乳児が睡眠または休息し、VCO2 が測定されます。 各呼気サンプルは、呼気流出液を還流冷却器内でバブリングさせ、試験管内に呼気を捕捉することにより、10 分間にわたって収集されます。 呼気サンプルは連続フロー同位体比質量分析計によって測定されます。 乳児のおむつの中に綿球を入れて尿サンプルを収集し、タンデム質量分析計で分析します。

統計分析

フェニルアラニンの流動、酸化、および F13CO2 に対するスレオニン摂取の影響は、PROC GLM 手順 (SAS バージョン 9.4) による分散分析を使用してテストされます。 平均スレオニン摂取量の推定値は、2 相線形回帰クロスオーバー モデルを使用した 13CO2 (F13CO2) データの放出速度のブレークポイント分析によって導出されます。 ブレークポイントは、混合モデルと SAS の回帰手順を使用して、直線の傾きがゼロから大きく変わらないように計算されます。 統計的有意性は P< 0.05 で確立されます。

回帰分析変数は、独立変数としてスレオニン、従属変数として F13CO2 およびフェニルアラニン酸化です。 最適なモデルの選択は、適合に関連する要素 (モデルの有意性と r2) およびモデルに関する変動の推定値 (推定値の CV と SE) によって決定されます。 母集団の推奨食事許容量は、ブレークポイント推定値の 95% 信頼限界の上限を決定することによって推定されます。