Uno studio fisiologico per determinare i requisiti di treonina enterale nei neonati di età compresa tra 1 e 6 mesi (INFORALTHR)

INTRODUZIONE

La treonina è un AA indispensabile che deve provenire da fonti alimentari. È fondamentale nella produzione di mucine nell'intestino (Law, Bertolo et al. 2007) e contribuisce in modo significativo alla formazione di collagene, elastina e smalto dei denti (Kramsch, Franzblau et al. 1971, Robinson, Lowe et al. 1975). L'attuale assunzione adeguata (AI) di treonina nei neonati proposta dall'Institute of Medicine, Food and Nutrition Board, nel 2005 Dietary Reference Intakes (DRIs) for macronutrients si basa su un approccio fattoriale a causa della mancanza di dati empirici conclusivi. Gli studi che hanno portato alla determinazione del fabbisogno di amminoacidi (AA) per i neonati hanno utilizzato la tecnica dell'analisi dell'azoto e sono stati eseguiti oltre 20 anni fa (Snyderman, Norton et al. 1959). I progressi metodologici hanno reso possibile determinare i requisiti di AA nell'uomo con una tecnica più precisa (Zello, Wykes et al. 1995). Tuttavia, non sono stati riportati studi sul fabbisogno di treonina nei neonati (1-6 mesi di età) con l'uso dei metodi più recenti basati sugli isotopi stabili.

Per determinare con precisione il fabbisogno di aminoacidi, è necessario fornire una gamma di assunzioni di aminoacidi. Per ragioni etiche, i neonati non possono essere alimentati con diete a basso o alto contenuto di amminoacidi per periodi di tempo prolungati. Il metodo minimamente invasivo IAAO, inizialmente sviluppato negli adulti nel nostro laboratorio (Zello, Pencharz et al. 1993) e ora utilizzato a livello internazionale (Huang, Hogewind-Schoonenboom et al. 2011) per determinare il fabbisogno di aminoacidi, risolve questo problema. Il metodo IAAO richiede meno di 24 ore per essere condotto ed è stato utilizzato in modo sicuro in neonati alimentati per via parenterale, neonati alimentati per via enterale, bambini e adulti.

Il nostro laboratorio ha determinato il fabbisogno enterale di treonina nei suinetti (Bertolo, Chen et al. 1998) che era di 0,42 g/kg/giorno. Siamo in grado di estrapolare da questi dati e proporre che il fabbisogno enterale per i neonati sia di 84 mg/kg/giorno. In questo studio determineremo il fabbisogno enterale per il bambino di età compresa tra 1 e 6 mesi e prevediamo che poiché la crescita rallenta e il fabbisogno proteico diminuisce dopo il primo mese di vita, il fabbisogno enterale dei neonati sarà simile all'IA del DRI di 73 mg /kg/gg. Pertanto, l'obiettivo di questo studio è determinare il fabbisogno di treonina enterale nei bambini da 1 a 6 mesi di età con il metodo IAAO.

MATERIE E METODI

Soggetti: Verranno eseguiti un totale di 18 studi in cui i partecipanti saranno randomizzati a 1 su 18 assunzioni di treonina di prova. I neonati di età compresa tra 1 e 6 mesi saranno reclutati dalla popolazione post-chirurgica ricoverata dell'Hospital for Sick Children (SickKids), Toronto, Canada. I partecipanti possono essere idonei a partecipare a più di un'assunzione di studio dopo l'arruolamento, essendo quindi randomizzati a una seconda assunzione di treonina. Tutte le procedure di studio e i moduli di consenso avranno l'approvazione del comitato etico della ricerca presso SickKids. Il permesso di arruolare i neonati nello studio sarà ottenuto dal chirurgo curante e il consenso informato scritto sarà ottenuto da uno o entrambi i genitori/tutori. Il reclutamento dei pazienti dovrebbe iniziare nel dicembre 2015. Lo studio è registrato su Clinicaltrials.gov # NCT02364843.

Saranno inclusi nello studio i neonati di età compresa tra 1 e 6 mesi, nati tra le 32 e le 43 settimane di età gestazionale, clinicamente stabili come determinato dai valori normali del sangue e dai segni vitali e ricoverati essere nutriti tramite sondino nasogastrico (NG-), digiunale (NJ- o J-) o gastrico (G-). I neonati saranno esclusi se stanno ricevendo ossigeno supplementare, sono ventilati meccanicamente, hanno anomalie endocrine o genetiche che potrebbero influenzare il metabolismo delle proteine ​​e degli AA, o stanno ricevendo farmaci che potrebbero influenzare il metabolismo delle proteine ​​e degli AA (es. terapia con corticosteroidi).

Disegno sperimentale e dieta di studio

Il disegno dello studio è il disegno IAAO minimamente invasivo, che si basa sul concetto che, poiché gli AA non sono immagazzinati nel corpo, l'assunzione di AA essenziali nella dieta in relazione al loro utilizzo per la sintesi proteica determina se sono ossidati o incorporati nelle proteine. Quando l'assunzione di un AA indispensabile è limitata, gli altri AA indispensabili sono in eccesso e vengono ossidati perché non possono essere incorporati nelle proteine ​​come precedentemente descritto (Zello, Pencharz et al. 1993). Ciascuno studio si svolgerà nell'arco di un periodo di 18-24 ore dopo la conferma da parte del dietista clinico del neonato che un'appropriata assunzione enterale di energia proteica e non proteica dai mangimi del neonato è stata somministrata nelle 24-48 ore precedenti il ​​giorno dello studio. In un giorno di studio (la durata sarà inferiore a 24 ore; vedi Fig. 1), il bambino riceverà una formula a base di una formula enterale senza proteine ​​commerciale (Pro-Phree) che fornisce una quantità nota di carboidrati, grassi , minerali, oligoelementi e vitamine appropriati per un lattante e ai quali verrà aggiunta una miscela di AA. Gli amminoacidi verranno aggiunti nel modello del latte materno come segue in mg·kg-1·d-1: Lys 207, Met 48, Leu 288, Ile 165, Val 165, Phe 126, Try 51, His 63, Tyr 156 , Arg 69, Pro 240, Cys 51, Gly 69, Ala 114, Ser 150, Asp 270, Glu 534 (OMS 2007). Ogni bambino riceverà un'assunzione diversa di treonina per studio e le 18 assunzioni per i 18 bambini cadranno su un continuum tra 15 e 130 mg·kg-1·d-1. Poiché l'assunzione di treonina è variata, le formule saranno mantenute come isonitrogene variando l'assunzione di alanina che è un AA superfluo. La miscela di amminoacidi verrà sottoposta a un filtro da 0,22 µ per garantire che sia sterile e priva di agenti patogeni. Questo è un ulteriore passo di sicurezza che non viene fatto con le formule commerciali ma è stato fatto con le nostre soluzioni parenterali durante lo studio dei requisiti di treonina e lisina nei neonati allattati parenteralmente (Chapman 2009, 2010). La combinazione della miscela di AA e della formulazione Pro-Phree preparata commercialmente sarà effettuata nella Formula Room dell'ospedale secondo le linee guida della procedura operativa standard (SOP) per la preparazione della formula clinica. I neonati riceveranno la formula dello studio tramite il sondino o una combinazione di alimenti per sondino e alimenti per via orale, durante il periodo di studio di 18-24 ore, come ordinato dal dietologo clinico.

Un tracciante isotopico stabile di livello di ricerca, prodotto dai Cambridge Isotope Laboratories (CIL), Maine, USA, verrà utilizzato per misurare l'ossidazione o la deposizione proteica in risposta alle diverse assunzioni di treonina. L'isotopo stabile è un amminoacido è L-[1-13C]fenilalanina, e viene somministrato con l'alimentazione del neonato alla dose di 15 µ·kg-1/h-1. Questo isotopo stabile si trova in tutti gli esseri umani come l'1% della percentuale totale dell'amminoacido fenilalanina e l'isotopo stabile stesso è stato utilizzato con successo e senza danni quando somministrato per via endovenosa ai bambini in 4 studi precedenti condotti presso The Hospital for Sick Children, Toronto Canada (Roberts 2001; Courtney Martin 2008; Chapman 2009, 2010).

Stiamo utilizzando un protocollo di studio che fornisce al bambino un tempo sufficiente per raggiungere uno stato stazionario con l'isotopo stabile 1-13CPhenylalanine al di sopra dei valori basali, come determinato dai nostri studi parenterali infantili (Chapman 2009, 2010). Condurremo i primi due studi utilizzando solo l'isotopo stabile della fenilalanina. Se all'analisi, scopriamo che non vediamo una differenza sufficiente tra i livelli basali e allo stato stazionario dell'isotopo stabile 1-13CPhenylalanine, allora introdurremo una dose una tantum di 13C-bicarbonato di sodio (NaH13CO2) a 14 μmol kg- 1 somministrato mediante tubo NG/G per permetterci di vedere una differenziazione tra la 1-13CPhenylalanine naturale del bambino e la quantità che somministriamo con la formula. Non crediamo che avremo bisogno di utilizzare l'isotopo del bicarbonato, ma abbiamo aggiunto al nostro protocollo per l'approvazione qualora il suo utilizzo si rendesse necessario. Viene utilizzato abitualmente da un gruppo di scienziati nei Paesi Bassi che studiano anche i fabbisogni di aminoacidi nei bambini e che non hanno segnalato alcun problema con la sua somministrazione (Hogewind-Schoonenboom 2014)

I traccianti di isotopi stabili sono etichettati "Solo per uso di ricerca" e sono accettabili per l'uso in esseri umani di tutte le età che saranno confermati dalla società produttrice di isotopi che fornirà un certificato di analisi con test per la purezza chimica, la presenza, se del caso, di metalli pesanti (in parti per milione) e test microbiologici compresi i pirogeni. Entrambi gli isotopi saranno preparati nella Diet Kitchen dell'ospedale al momento della preparazione della formula dello studio secondo le stesse linee guida SOP delle diete cliniche.

Raccolta e analisi dei campioni

Saranno raccolti campioni di respiro e urina per determinare i cambiamenti nella risposta dei neonati alla dieta in studio. Saranno raccolti tre campioni di respiro e urina al basale prima dell'introduzione della dieta in studio. Quattro campioni di respiro e urina di plateau saranno raccolti ogni ora a partire da 12-18 ore dopo l'introduzione dei traccianti marcati con isotopi stabili di grado Research. I campioni di respiro verranno raccolti utilizzando un carrello analizzatore di anidride carbonica che è simile nel design e nell'uso a un dispositivo di test clinico chiamato calorimetro. Entrambi i dispositivi utilizzano un sistema di cappa ventilata sotto il quale i neonati dormono o riposano e viene misurato il VCO2. Ogni campione di respiro sarà raccolto per un periodo di 10 minuti facendo gorgogliare l'effluente del respiro in un condensatore a riflusso e intrappolando il respiro in una provetta. I campioni di respiro saranno misurati mediante uno spettrometro di massa a rapporto isotopico a flusso continuo. I campioni di urina saranno raccolti mettendo batuffoli di cotone nei pannolini del bambino e analizzati su uno spettrometro di massa tandem.

analisi statistica

L'effetto dell'assunzione di treonina sul flusso di fenilalanina, ossidazione e F13CO2 sarà testato utilizzando l'analisi della varianza con la procedura PROC GLM (SAS versione 9.4). Le stime dell'assunzione media di treonina saranno derivate dall'analisi del breakpoint del tasso di rilascio dei dati di 13CO2 (F13CO2) con l'uso di un modello crossover di regressione lineare a 2 fasi. Il breakpoint sarà calcolato utilizzando i modelli misti e la procedura di regressione di SAS con la pendenza della linea non significativamente diversa da zero. La significatività statistica sarà stabilita a P<0.05.

Le variabili dell'analisi di regressione sono la treonina come variabile indipendente e F13CO2 e l'ossidazione della fenilalanina come variabili dipendenti. La selezione del modello migliore sarà determinata da fattori relativi all'adattamento (significatività del modello e r2) e stime di variazione rispetto al modello (CV e SE della stima). L'indennità dietetica raccomandata per la popolazione sarà stimata determinando i limiti di confidenza superiori al 95% della stima del breakpoint.