Badanie fizjologiczne w celu określenia zapotrzebowania na treoninę dojelitową u niemowląt w wieku od 1 do 6 miesięcy (INFORALTHR)

WSTĘP

Treonina jest niezbędnym AA, który musi pochodzić ze źródeł dietetycznych. Ma kluczowe znaczenie w produkcji mucyn w jelitach (Law, Bertolo i wsp. 2007) i znacząco przyczynia się do tworzenia kolagenu, elastyny ​​i szkliwa zębów (Kramsch, Franzblau i wsp. 1971, Robinson, Lowe i wsp. 1975). Obecne odpowiednie spożycie (AI) treoniny u niemowląt zaproponowane przez Instytut Medycyny, Radę ds. Żywności i Żywienia w referencyjnych wartościach spożycia (DRI) z 2005 r. dla makroskładników odżywczych opiera się na podejściu czynnikowym ze względu na brak rozstrzygających danych empirycznych. Badania, które doprowadziły do ​​określenia zapotrzebowania na aminokwasy (AA) u niemowląt, wykorzystywały technikę analizy azotu i zostały przeprowadzone ponad 20 lat temu (Snyderman, Norton i in. 1959). Postęp metodologiczny umożliwił określenie wymagań AA u ludzi za pomocą bardziej precyzyjnej techniki (Zello, Wykes i in. 1995). Nie ma jednak doniesień o badaniach zapotrzebowania na treoninę u niemowląt (w wieku 1-6 miesięcy) z zastosowaniem nowszych metod oznaczania stabilnych izotopów.

Aby dokładnie określić zapotrzebowanie na aminokwasy, konieczne jest zapewnienie zakresu spożycia aminokwasów. Ze względów etycznych niemowlęta nie mogą być karmione dietą o bardzo niskiej lub wysokiej zawartości aminokwasów testowych przez dłuższy czas. Minimalnie inwazyjna metoda IAAO, początkowo opracowana u dorosłych w naszym laboratorium (Zello, Pencharz i wsp. 1993), a obecnie stosowana na całym świecie (Huang, Hogewind-Schoonenboom i wsp. 2011) w celu określenia zapotrzebowania na aminokwasy, rozwiązuje ten problem. Metoda IAAO zajmuje mniej niż 24 godziny i jest bezpiecznie stosowana u noworodków karmionych pozajelitowo, dojelitowo, dzieci i dorosłych.

Nasze laboratorium określiło dojelitowe zapotrzebowanie prosiąt na treoninę (Bertolo, Chen i in. 1998), które wynosiło 0,42 g/kg/d. Jesteśmy w stanie ekstrapolować te dane i zaproponować, że zapotrzebowanie dojelitowe dla noworodków wynosiłoby 84 mg/kg/d. W tym badaniu będziemy określać zapotrzebowanie dojelitowe dla niemowląt w wieku od 1 do 6 miesięcy i przewidywać, że ponieważ wzrost spowalnia, a zapotrzebowanie na białko spada po pierwszym miesiącu życia, zapotrzebowanie dojelitowe niemowląt będzie podobne do AI DRI wynoszącej 73 mg /kg/d. Dlatego celem pracy jest określenie dojelitowego zapotrzebowania na treoninę u niemowląt od 1 do 6 miesiąca życia metodą IAAO.

TEMATY I METODY

Uczestnicy: W sumie zostanie przeprowadzonych 18 badań, w których uczestnicy zostaną losowo przydzieleni do 1 z 18 testowych dawek treoniny. Niemowlęta w wieku od 1 do 6 miesięcy będą rekrutowane spośród hospitalizowanych pacjentów pooperacyjnych Hospital for Sick Children (SickKids) w Toronto w Kanadzie. Uczestnicy mogą kwalifikować się do udziału w więcej niż jednym badaniu po włączeniu, dlatego są losowo przydzielani do drugiego spożycia treoniny. Wszystkie procedury badawcze i formularze zgody będą podlegały zatwierdzeniu przez radę ds. etyki badań w SickKids. Pozwolenie na włączenie niemowląt do badania zostanie uzyskane od prowadzącego chirurga, a pisemna świadoma zgoda zostanie uzyskana od jednego lub obojga rodziców/opiekunów. Rekrutacja pacjentów ma rozpocząć się w grudniu 2015 r. Badanie jest zarejestrowane na stronie Clinicaltrials.gov # NCT02364843.

Niemowlęta zostaną włączone do badania, jeśli są w wieku od 1 do 6 miesięcy, urodziły się między 32 a 43 tygodniem ciąży, są klinicznie stabilne, co określono na podstawie prawidłowych wartości krwi i parametrów życiowych, oraz są pacjentami hospitalizowanymi, którzy karmione przez sondę nosowo-żołądkową (NG-), jelitową (NJ- lub J-) lub żołądkową (G-). Niemowlęta zostaną wykluczone, jeśli otrzymują dodatkowy tlen, są wentylowane mechanicznie, mają jakiekolwiek anomalie endokrynologiczne lub genetyczne, które mogłyby wpływać na metabolizm białek i AA, lub otrzymują leki, które mogłyby wpływać na metabolizm białek i AA (np. terapia kortykosteroidami).

Eksperymentalny projekt i dieta badawcza

Projekt badania to minimalnie inwazyjny projekt IAAO, który opiera się na koncepcji, że ponieważ AA nie są magazynowane w organizmie, spożycie niezbędnych AA w diecie w stosunku do ich wykorzystania do syntezy białek określa, czy zostaną one utlenione, czy włączone do białka. Kiedy spożycie jednego niezbędnego AA jest ograniczone, inne niezbędne AA są w nadmiarze i ulegają utlenieniu, ponieważ nie mogą być włączone do białka, jak opisano wcześniej (Zello, Pencharz i in. 1993). Każde badanie będzie trwało 18-24 godzin po potwierdzeniu przez dietetyka klinicznego niemowlęcia, że ​​w okresie od 24 do 48 godzin poprzedzających dzień badania niemowlę otrzymało odpowiednią dawkę dojelitową białka i energii niebiałkowej z pokarmu niemowlęcia. W ciągu jednego dnia badania (czas trwania badania będzie krótszy niż 24 godziny; zob. ryc. 1) niemowlę otrzyma mleko modyfikowane sporządzone z dostępnej w handlu mieszanki dojelitowej bez białka (Pro-Phree), która dostarcza znaną ilość węglowodanów, tłuszczów , minerały, pierwiastki śladowe i witaminy odpowiednie dla niemowlęcia, do których zostanie dodana mieszanka AA. Aminokwasy zostaną dodane do mleka kobiecego w następujący sposób w mg·kg-1·d-1: Lys 207, Met 48, Leu 288, Ile 165, Val 165, Phe 126, Try 51, His 63, Tyr 156 , Arg 69, Pro 240, Cys 51, Gly 69, Ala 114, Ser 150, Asp 270, Glu 534 (WHO 2007). Każde niemowlę otrzyma inne spożycie treoniny na badanie, a 18 dawek dla 18 niemowląt będzie mieścić się w kontinuum między 15 a 130 mg·kg-1·d-1. Ponieważ spożycie treoniny jest zróżnicowane, formuły będą utrzymywane jako izoazotowe poprzez różne spożycie alaniny, która jest zbędnym AA. Mieszanina aminokwasów zostanie przepuszczona przez filtr 0,22 µ, aby upewnić się, że jest sterylna i wolna od patogenów. Jest to dodatkowy krok bezpieczeństwa, który nie jest wykonywany w przypadku preparatów komercyjnych, ale został wykonany w przypadku naszych roztworów do podawania pozajelitowego podczas badania zapotrzebowania na treoninę i lizynę u niemowląt karmionych pozajelitowo (Chapman 2009, 2010). Połączenie mieszaniny AA i komercyjnie przygotowanej formuły Pro-Phree zostanie przeprowadzone w szpitalnym pokoju formuł zgodnie z wytycznymi standardowej procedury operacyjnej (SOP) dotyczącej przygotowania formuły klinicznej. Niemowlęta będą otrzymywać badaną formułę przez zgłębnik lub kombinację karmienia przez zgłębnik i pokarmu doustnego w ciągu 18-24 godzinnego okresu badania, zgodnie z zaleceniami dietetyka klinicznego.

Znacznik stabilnych izotopów klasy badawczej, wyprodukowany przez Cambridge Isotope Laboratories (CIL), Maine, USA, zostanie wykorzystany do pomiaru utleniania lub odkładania się białek w odpowiedzi na zmienne spożycie treoniny. Trwałym izotopem jest aminokwas L-[1-13C]fenyloalanina, podawany z pokarmami dla niemowląt w dawce 15 µ·kg-1/h-1. Ten stabilny izotop występuje u wszystkich ludzi jako 1% całkowitego procentu aminokwasu fenyloalaniny, a sam stabilny izotop był stosowany z powodzeniem i bez szkody, gdy był podawany dożylnie niemowlętom w 4 poprzednich badaniach przeprowadzonych w The Hospital for Sick Children, Toronto Kanada (Roberts 2001; Courtney Martin 2008; Chapman 2009, 2010).

Stosujemy protokół badania, który zapewnia niemowlęciu wystarczająco dużo czasu, aby osiągnąć stan stacjonarny ze stabilnym izotopem 1-13CPenyloalaniny powyżej wartości wyjściowych, jak określono w naszych badaniach pozajelitowych niemowląt (Chapman 2009, 2010). Pierwsze dwa badania przeprowadzimy używając tylko stabilnego izotopu fenyloalaniny. Jeśli podczas analizy stwierdzimy, że nie widzimy wystarczającej różnicy między poziomem wyjściowym a stanem ustalonym stabilnego izotopu 1-13CPfenyloalaniny, wówczas wprowadzimy jednorazową dawkę wodorowęglanu sodu 13C (NaH13CO2) w ilości 14 μmol kg- 1 podawano przez sondę NG/G, aby umożliwić nam dostrzeżenie różnicy między naturalnie występującą u niemowlęcia 1-13CPenyloalaniną a ilością, którą podajemy z mieszanką. Nie sądzimy, że będziemy musieli używać izotopu wodorowęglanu, ale dodaliśmy do naszego protokołu zatwierdzenie, gdyby jego użycie stało się konieczne. Jest rutynowo stosowany przez grupę naukowców w Holandii, którzy również badają zapotrzebowanie niemowląt na aminokwasy i którzy nie zgłosili żadnych problemów z jego podawaniem (Hogewind-Schoonenboom 2014)

Wskaźniki stabilnych izotopów są oznaczone jako „Tylko do użytku badawczego” i są dopuszczone do stosowania u ludzi w każdym wieku, co zostanie potwierdzone przez firmę produkującą izotopy, która dostarczy Certyfikat Analizy wraz z badaniem czystości chemicznej, obecności, jeśli występuje, metale ciężkie (w częściach na milion) oraz badania mikrobiologiczne, w tym pirogeny. Oba izotopy zostaną przygotowane w Kuchni Dietetycznej szpitala na czas przygotowania formuły badania według tych samych wytycznych SOP, co diety kliniczne.

Pobieranie i analiza próbek

Zostaną pobrane próbki oddechu i moczu w celu określenia zmian w reakcji niemowląt na badaną dietę. Przed wprowadzeniem badanej diety zostaną pobrane trzy podstawowe próbki oddechu i moczu. Cztery próbki oddechu i moczu będą pobierane co godzinę, począwszy od 12-18 godzin po wprowadzeniu znaczników oznaczanych stabilnymi izotopami klasy badawczej. Próbki oddechu będą pobierane przy użyciu wózka analizatora dwutlenku węgla, który jest podobny pod względem konstrukcji i zastosowania do klinicznego urządzenia testowego zwanego kalorymetrem. Oba urządzenia wykorzystują wentylowany kaptur, pod którym niemowlęta śpią lub odpoczywają i mierzone jest VCO2. Każda próbka wydychanego powietrza będzie pobierana przez okres 10 minut poprzez przepuszczanie wydychanego powietrza przez chłodnicę zwrotną i uwięzienie wydychanego powietrza w probówce. Próbki oddechu będą mierzone za pomocą spektrometru masowego stosunku izotopów z przepływem ciągłym. Próbki moczu będą pobierane poprzez umieszczanie wacików w pieluchach niemowląt i analizowane na tandemowym spektrometrze mas.

Analiza statystyczna

Wpływ spożycia treoniny na przepływ fenyloalaniny, utlenianie i F13CO2 zostanie przetestowany przy użyciu analizy wariancji z procedurą PROC GLM (wersja SAS 9.4). Oszacowania średniego spożycia treoniny zostaną uzyskane na podstawie analizy punktów granicznych danych dotyczących szybkości uwalniania 13CO2 (F13CO2) przy użyciu dwufazowego modelu krzyżowego regresji liniowej. Punkt przerwania zostanie obliczony przy użyciu modeli mieszanych i procedury regresji SAS, przy czym nachylenie linii nie będzie istotnie różne od zera. Istotność statystyczna zostanie ustalona przy P<0,05.

Zmiennymi analizy regresji są treonina jako zmienna niezależna oraz F13CO2 i utlenianie fenyloalaniny jako zmienne zależne. Wybór najlepszego modelu zostanie określony przez czynniki związane z dopasowaniem (istotność modelu i r2) oraz oszacowania zmienności modelu (CV i SE oszacowania). Zalecane spożycie dietetyczne dla populacji zostanie oszacowane poprzez określenie górnych 95% przedziałów ufności szacunkowej wartości granicznej.