Fysiologinen tutkimus enteraalisen treoniinitarpeen määrittämiseksi 1–6 kuukauden ikäisillä vauvoilla (INFORALTHR)

JOHDANTO

Treoniini on välttämätön AA, jonka on oltava peräisin ravinnosta. Se on kriittinen musiinien tuotannossa suolistossa (Law, Bertolo et al. 2007) ja edistää merkittävästi kollageenin, elastiinin ja hammaskiilteen muodostumista (Kramsch, Franzblau et al. 1971, Robinson, Lowe et al. 1975). Institute of Medicine, Food and Nutrition Boardin (2005 Dietary Reference Intakes, DRI) makroravintoaineiden tämänhetkinen riittävä treoniinin saanti (AI) vauvoilla, jota ehdotti, perustuu tekijöihin perustuvaan lähestymistapaan, koska vakuuttavia empiirisiä tietoja ei ole saatavilla. Tutkimukset, jotka johtivat aminohappotarpeiden (AA) määrittämiseen imeväisille, käyttivät typpianalyysitekniikkaa, ja ne suoritettiin yli 20 vuotta sitten (Snyderman, Norton et al. 1959). Metodologiset edistysaskeleet ovat tehneet mahdolliseksi määrittää AA-vaatimukset ihmisillä tarkemmalla tekniikalla (Zello, Wykes et al. 1995). Ei kuitenkaan ole raportoitu tutkimuksia vauvojen (1-6 kuukauden ikäisten) treoniinin tarpeesta uudemmilla stabiilien isotooppimenetelmillä.

Aminohappotarpeen määrittämiseksi tarkasti on tarpeen tarjota erilaisia ​​aminohappojen saantia. Eettisistä syistä pikkulapsia ei voida ruokkia pitkiä aikoja erittäin vähä- tai runsaasti aminohappoa sisältävällä ruokavaliolla. Minimaalisesti invasiivinen IAAO-menetelmä, joka alun perin kehitettiin aikuisille laboratoriossamme (Zello, Pencharz et al. 1993) ja jota nyt käytetään kansainvälisesti (Huang, Hogewind-Schoonenboom et al. 2011) aminohappotarpeen määrittämiseen, ratkaisee tämän ongelman. IAAO-menetelmän suorittaminen kestää alle 24 tuntia, ja sitä on käytetty turvallisesti parenteraalisesti ruokittujen vastasyntyneiden, enteraalisesti ruokittujen vastasyntyneiden, lasten ja aikuisten kohdalla.

Laboratoriomme määritti porsaiden enteraalisen treoniinin tarpeen (Bertolo, Chen et al. 1998), joka oli 0,42 g/kg/d. Pystymme ekstrapoloimaan näistä tiedoista ja ehdottamaan, että vastasyntyneiden enteraalinen tarve olisi 84 mg/kg/vrk. Tässä tutkimuksessa määritämme enteraalisen tarpeen 1–6 kuukauden ikäiselle lapselle ja ennustamme, että koska kasvu hidastuu ja proteiinitarve pienenee ensimmäisen elinkuukauden jälkeen, imeväisten enteraalinen tarve on samanlainen kuin DRI:n AI 73 mg. /kg/pv. Siten tämän tutkimuksen tavoitteena on määrittää enteraalinen treoniinin tarve 1-6 kuukauden ikäisillä imeväisillä IAAO-menetelmällä.

AINEET JA MENETELMÄT

Aiheet: Suoritetaan yhteensä 18 tutkimusta, joissa osallistujat satunnaistetaan yhteen 18:sta testitreoniinin saannista. 1–6 kuukauden ikäiset pikkulapset rekrytoidaan Torontossa, Kanadassa sijaitsevan sairaalan sairaiden lasten sairaalan (SickKids) leikkauksen jälkeisestä sairaalahoidosta. Osallistujat voivat olla oikeutettuja osallistumaan useampaan kuin yhteen tutkimussaantiin ilmoittautumisen jälkeen, minkä vuoksi heidät satunnaistetaan toiseen treoniinin saantiin. Kaikilla opiskelumenettelyillä ja suostumuslomakkeilla on SickKidsin tutkimuseettisen lautakunnan hyväksyntä. Lupa imeväisten rekisteröintiin tutkimukseen hankitaan hoitavalta kirurgilta ja kirjallinen tietoinen suostumus yhdeltä tai molemmilta vanhemmilta/huoltajilta. Potilaiden rekrytoinnin odotetaan alkavan joulukuussa 2015. Tutkimus on rekisteröity klinikalla.gov # NCT02364843.

Vauvat otetaan mukaan tutkimukseen, jos he ovat iältään 1–6 kuukauden ikäisiä, syntyneet 32 ​​viikon ja 43 viikon raskausiässä, ovat kliinisesti stabiileja normaalien veriarvojen ja elintoimintojen perusteella ja ovat sairaalahoidossa ruokinta nenämahaletkun (NG-), jejunaalisen (NJ- tai J-) tai mahalaukun (G-) kautta. Vauvat suljetaan pois, jos he saavat lisähappea, he ovat koneellisesti tuuletettuja, heillä on endokriinisiä tai geneettisiä poikkeavuuksia, jotka voivat vaikuttaa proteiini- ja AA-aineenvaihduntaan, tai jos he saavat lääkitystä, joka vaikuttaa proteiini- ja AA-aineenvaihduntaan (esim. kortikosteroidihoito).

Kokeellinen suunnittelu ja tutkimusruokavalio

Tutkimussuunnitelma on minimaalisesti invasiivinen IAAO-design, joka perustuu ajatukseen, että koska AA:t eivät varastoidu elimistöön, ravinnon välttämättömien AA:iden saanti suhteessa niiden käyttöön proteiinisynteesiin määrää, ovatko ne hapettuneet vai sisällytetty proteiiniin. Kun yhden välttämättömän AA:n saantia rajoitetaan, muut välttämättömät AA:t ovat ylimäärin ja ne hapettuvat, koska niitä ei voida sisällyttää proteiiniin, kuten aiemmin on kuvattu (Zello, Pencharz et ai. 1993). Kukin tutkimus suoritetaan 18–24 tunnin ajan sen jälkeen, kun vauvan kliininen ravitsemusterapeutti on vahvistanut, että vauvan ruokinnasta on saatu riittävästi proteiinia ja ei-proteiinista energiaa 24–48 tunnin aikana ennen tutkimuspäivää. Yhtenä tutkimuspäivänä (kesto on alle 24 tuntia; katso kuva 1) vauva saa maitoa, joka on valmistettu kaupallisesta proteiinittomasta enteraalisesta kaavasta (Pro-Phree), joka toimittaa tunnetun määrän hiilihydraattia ja rasvaa , kivennäisaineita, hivenaineita ja vitamiineja, jotka sopivat lapselle ja joihin lisätään AA-seosta. Aminohappoja lisätään rintamaidon malliin seuraavasti yksiköissä mg·kg-1·d-1: Lys 207, Met 48, Leu 288, Ile 165, Val 165, Phe 126, Try 51, His 63, Tyr 156 , Arg 69, Pro 240, Cys 51, Gly 69, Ala 114, Ser 150, Asp 270, Glu 534 (WHO 2007). Jokainen vauva saa eri treoniinin saantia tutkimusta kohden, ja 18 vauvan saantia lasketaan jatkumolle välillä 15-130 mg·kg-1·d-1. Koska treoniinin saanti vaihtelee, kaavat säilyvät isonitrogeenisina vaihtelemalla alaniinin saantia, joka on välttämätön AA. Aminohapposeos laitetaan 0,22 µ suodattimen läpi sen varmistamiseksi, että se on steriili ja patogeenivapaa. Tämä on lisäturvatoimenpide, jota ei tehdä kaupallisilla valmisteilla, vaan se tehtiin parenteraalisilla liuoksillamme tutkittaessa treoniini- ja lysiinitarpeita parenteraalisesti ruokittujen imeväisten (Chapman 2009, 2010). AA-seoksen ja kaupallisesti valmistetun Pro-Phree-formulaation yhdistäminen tehdään sairaalan Formula Roomissa niiden kliinisen kaavan valmistukseen liittyvien SOP-ohjeiden mukaisesti. Vauvat saavat tutkimusrehua syöttöletkun kautta tai putkiruokien ja suun kautta annettavien ruokien yhdistelmän 18–24 tunnin tutkimusjakson aikana kliinisen ravitsemusterapeutin määräämällä tavalla.

Cambridge Isotope Laboratoriesin (CIL, Maine, USA) valmistamaa tutkimustason stabiilia isotooppimerkkiainetta käytetään hapettumisen tai proteiinin kertymisen mittaamiseen vasteena treoniinin vaihtelevaan saantiin. Stabiili isotooppi on aminohappo L-[1-13C]fenyylialaniini, ja sitä annetaan vauvan ruokien kanssa annoksena 15 µ·kg-1/h-1. Tätä stabiilia isotooppia löytyy kaikista ihmisistä, koska 1 % aminohapon fenyylialaniinin kokonaisprosentista, ja itse stabiilia isotooppia on käytetty onnistuneesti ja ilman haittaa, kun se on annettu suonensisäisesti vauvoille neljässä aikaisemmassa tutkimuksessa, jotka tehtiin The Hospital for Sick Children, Torontossa. Kanada (Roberts 2001; Courtney Martin 2008; Chapman 2009, 2010).

Käytämme tutkimusprotokollaa, joka antaa lapselle riittävästi aikaa saavuttaa vakaan tilan vakaan 1-13CP-fenyylialaniini-isotoopin ollessa perusarvojen yläpuolella, jotka on määritetty imeväisten parenteraalisissa tutkimuksissamme (Chapman 2009, 2010). Suoritamme kaksi ensimmäistä tutkimusta käyttämällä vain fenyylialaniinin stabiilia isotooppia. Jos analyysissä huomaamme, että emme näe riittävää eroa 1-13CP-fenyylialaniinin stabiilin isotoopin perus- ja vakaan tilan välillä, otamme käyttöön kerta-annoksen 13C-natriumbikarbonaattia (NaH13CO2) 14 μmol kg- 1 annetaan NG/G-letkulla, jotta voimme nähdä eron vauvan luonnollisesti esiintyvän 1-13CP-fenyylialaniinin ja kaavan kanssa antamamme määrän välillä. Emme usko, että meidän tarvitsee käyttää bikarbonaatti-isotooppia, mutta olemme lisänneet protokollamme hyväksyntää varten, jos sen käyttö tulee tarpeelliseksi. Sitä käyttää rutiininomaisesti joukko tutkijoita Alankomaissa, jotka myös tutkivat pikkulasten aminohappotarpeita ja jotka eivät ole raportoineet mistään sen antamiseen liittyvistä ongelmista (Hogewind-Schoonenboom 2014).

Stabiilit isotooppimerkkiaineet on merkitty "Vain tutkimuskäyttöön" ja ne ovat hyväksyttäviä käytettäväksi kaiken ikäisille ihmisille, minkä Isotooppia valmistava yritys vahvistaa ja toimittaa analyysitodistuksen, jossa testataan kemiallinen puhtaus, mahdolliset raskasmetallit (miljoonasosina) ja mikrobiologiset testaukset, mukaan lukien pyrogeenit. Molemmat isotoopit valmistetaan sairaalan Ruokavaliokeittiössä tutkimuskaavan laadinnan yhteydessä samojen SOP-ohjeiden mukaisesti kuin kliiniset ruokavaliot.

Näytteenotto ja analyysi

Hengitysnäytteitä ja virtsaa kerätään, jotta voidaan määrittää muutokset imeväisten vasteessa tutkimusruokavalioon. Ennen tutkimusruokavalion käyttöönottoa otetaan kolme lähtötilanteen hengitys- ja virtsanäytettä. Neljä tasangohengitys- ja virtsanäytettä kerätään tunnin välein alkaen 12-18 tunnin kuluttua tutkimusluokan stabiilien isotooppileimattujen merkkiaineiden käyttöönotosta. Hengitysnäytteet kerätään käyttämällä hiilidioksidianalysaattorikärryä, joka on rakenteeltaan ja käytöltään samanlainen kuin kliininen testilaite, jota kutsutaan kalorimetriksi. Molemmissa laitteissa on tuuletettu huppu, jonka alla vauvat nukkuvat tai lepäävät ja VCO2 mitataan. Jokainen hengitysnäyte kerätään 10 minuutin aikana kuplittamalla uloshengitysvirta palautusjäähdyttimeen ja pidättämällä hengitys koeputkeen. Hengitysnäytteet mitataan jatkuvan virtauksen isotooppisuhteen massaspektrometrillä. Virtsanäytteet otetaan asettamalla pumpulipalloja vauvan vaipoihin ja analysoidaan tandemmassaspektrometrillä.

Tilastollinen analyysi

Treoniinin saannin vaikutus fenyylialaniinivirtaukseen, hapettumiseen ja F13CO2:een testataan käyttämällä varianssianalyysiä PROC GLM -menettelyllä (SAS versio 9.4). Arviot keskimääräisestä treoniinin saannista johdetaan 13CO2 (F13CO2) -tietojen vapautumisnopeuden katkaisupisteanalyysillä käyttämällä 2-vaiheista lineaarista regressiojakomallia. Katkaisupiste lasketaan SAS:n sekamalleilla ja regressiomenettelyllä siten, että suoran kaltevuus ei eroa merkittävästi nollasta. Tilastollinen merkitsevyys määritetään arvoon P < 0,05.

Regressioanalyysin muuttujat ovat treoniini itsenäisenä muuttujana ja F13CO2 ja fenyylialaniinin hapettuminen riippuvina muuttujina. Parhaan mallin valinta määräytyy sopivuuteen liittyvien tekijöiden (mallin merkitys ja r2) sekä mallin vaihteluarvioiden (estimaatin CV ja SE) perusteella. Väestön suositeltu ruokavalion saanti arvioidaan määrittämällä raja-arvoarvion 95 %:n yläluottamusrajat.