Fyziologická studie ke stanovení požadavků na enterální threonin u kojenců ve věku 1 až 6 měsíců (INFORALTHR)

ÚVOD

Threonin je nepostradatelný AA, který musí pocházet z dietních zdrojů. Je rozhodující při produkci mucinů ve střevě (Law, Bertolo a kol. 2007) a významně přispívá k tvorbě kolagenu, elastinu a zubní skloviny (Kramsch, Franzblau a kol. 1971, Robinson, Lowe a kol. 1975). Současný adekvátní příjem (AI) threoninu u kojenců navržený Institutem medicíny, potravin a výživy Board v Dietary Reference Intakes (DRI) pro makronutrienty z roku 2005 je založen na faktoriálním přístupu kvůli nedostatku přesvědčivých empirických dat. Studie, které vedly ke stanovení požadavků na aminokyseliny (AA) u kojenců, používaly techniku ​​analýzy dusíku a byly provedeny před více než 20 lety (Snyderman, Norton et al. 1959). Metodologický pokrok umožnil stanovit požadavky na AA u lidí přesnější technikou (Zello, Wykes et al. 1995). Nebyly však hlášeny žádné studie potřeby threoninu u kojenců (1-6 měsíců věku) s použitím novějších metod stabilních izotopů.

Pro přesné stanovení požadavků na aminokyseliny je nutné zajistit rozsah příjmu aminokyselin. Z etických důvodů nemohou být kojenci po delší dobu krmeni dietou s velmi nízkým nebo vysokým obsahem testovaných aminokyselin. Minimálně invazivní metoda IAAO, původně vyvinutá u dospělých v naší laboratoři (Zello, Pencharz et al. 1993) a nyní používaná mezinárodně (Huang, Hogewind-Schoonenboom et al. 2011) ke stanovení požadavků na aminokyseliny, tento problém překonává. Provedení metody IAAO trvá méně než 24 hodin a byla bezpečně použita u novorozenců krmených parenterálně, novorozenců živených enterálně, dětí a dospělých.

Naše laboratoř stanovila enterální potřebu threoninu u selat (Bertolo, Chen et al. 1998), která byla 0,42 g/kg/den. Z těchto údajů jsme schopni extrapolovat a navrhnout, aby enterální požadavek pro novorozence byl 84 mg/kg/den. V této studii budeme určovat enterální potřebu pro kojence ve věku 1-6 měsíců a předpovědět, že jelikož se růst zpomaluje a potřeba bílkovin po prvním měsíci života klesá, enterální potřeba kojenců bude podobná AI DRI 73 mg. /kg/d. Cílem této studie je tedy stanovení enterální potřeby threoninu u kojenců ve věku od 1 do 6 měsíců metodou IAAO.

PŘEDMĚTY A METODY

Subjekty: Bude provedeno celkem 18 studií, kde budou účastníci randomizováni k 1 z 18 testovacích příjemů threoninu. Kojenci ve věku od 1 do 6 měsíců se budou rekrutovat z hospitalizované populace po chirurgickém zákroku v Nemocnici pro nemocné děti (SickKids), Toronto, Kanada. Účastníci mohou být způsobilí zúčastnit se více než jednoho příjmu studie po zápisu, proto jsou randomizováni k druhému příjmu threoninu. Všechny studijní postupy a formuláře souhlasu budou schváleny etickou radou pro výzkum v SickKids. Povolení k zařazení kojenců do studie bude získáno od ošetřujícího chirurga a písemný informovaný souhlas bude získán od jednoho nebo obou rodičů/opatrovníků. Očekává se, že nábor pacientů začne v prosinci 2015. Studie je registrována na Clinictrials.gov # NCT02364843.

Do studie budou zařazeni kojenci, kteří jsou ve věku od 1 do 6 měsíců, narodili se mezi 32. a 43. týdnem gestačního věku, jsou klinicky stabilní podle normálních krevních hodnot a vitálních funkcí a jsou hospitalizovanými pacienty. při výživě nazogastrickou (NG-), jejunální (NJ- nebo J-) nebo žaludeční (G-) sondou. Kojenci budou vyloučeni, pokud dostávají doplňkový kyslík, jsou mechanicky ventilováni, mají jakékoli endokrinní nebo genetické anomálie, které by ovlivňovaly metabolismus bílkovin a AA, nebo dostávají léky, které by ovlivňovaly metabolismus bílkovin a AA (např. kortikosteroidní terapie).

Experimentální design a studijní dieta

Design studie je minimálně invazivní design IAAO, který je založen na konceptu, že protože AA nejsou uloženy v těle, příjem esenciálních AA ve stravě ve vztahu k jejich použití pro syntézu proteinů určuje, zda jsou oxidovány nebo inkorporovány do proteinu. Když je omezen příjem jedné nepostradatelné AA, ostatní nepostradatelné AA jsou v nadbytku a jsou oxidovány, protože nemohou být začleněny do proteinu, jak bylo popsáno dříve (Zello, Pencharz et al. 1993). Každá studie bude probíhat po dobu 18 až 24 hodin po potvrzení klinického dietologa dítěte, že během 24 až 48 hodin před dnem studie byl dodán vhodný enterální příjem bílkovin a nebílkovinné energie z potravy dítěte. V jeden den studie (doba trvání, která bude kratší než 24 hodin; viz obr. 1), dítě dostane výživu vyrobenou z komerčního enterálního výživy bez proteinů (Pro-Phree), která dodává známé množství sacharidů, tuků , minerály, stopové prvky a vitamíny vhodné pro kojence a do kterých bude přidána směs AA. Aminokyseliny budou přidávány do mateřského mléka následovně v mg·kg-1·d-1: Lys 207, Met 48, Leu 288, Ile 165, Val 165, Phe 126, Try 51, His 63, Tyr 156 Arg 69, Pro 240, Cys 51, Gly 69, Ala 114, Ser 150, Asp 270, Glu 534 (WHO 2007). Každé dítě dostane různý příjem threoninu na studii a 18 příjemů pro 18 kojenců bude spadat do kontinua mezi 15 a 130 mg.kg-1.d-1. Vzhledem k tomu, že příjem threoninu je různý, přípravky budou udržovány jako izodusíkaté změnou příjmu alaninu, který je postradatelný AA. Aminokyselinová směs se nechá projít 0,22 µ filtrem, aby se zajistilo, že je sterilní a bez patogenů. Jedná se o další bezpečnostní krok, který se neprovádí u komerčních přípravků, ale byl proveden s našimi parenterálními roztoky při studiu požadavků na threonin a lysin u parenterálně krmených kojenců (Chapman 2009, 2010). Kombinace směsi AA a komerčně připravené formulace Pro-Phree bude prováděna v nemocniční Formula Room podle pokynů pro standardní operační postupy (SOP) pro přípravu klinické formulace. Kojenci budou dostávat studovanou výživu prostřednictvím své krmné sondy nebo kombinaci krmení sondou a perorálního krmení po dobu 18 až 24 hodin studie podle pokynů klinického dietologa.

Stabilní izotopový indikátor pro výzkum, vyrobený společností Cambridge Isotope Laboratories (CIL), Maine, USA, bude použit k měření oxidace nebo ukládání proteinů v reakci na měnící se příjem threoninu. Stabilním izotopem je aminokyselina L-[1-13C]fenylalanin a podává se s kojeneckou výživou v dávce 15 µ·kg-1/h-1. Tento stabilní izotop se nachází u všech lidí jako 1 % z celkového procenta aminokyseliny fenylalaninu a samotný stabilní izotop byl úspěšně a bez poškození používán při intravenózním podání kojencům ve 4 předchozích studiích provedených v The Hospital for Sick Children, Toronto. Kanada (Roberts 2001; Courtney Martin 2008; Chapman 2009, 2010).

Používáme protokol studie, který poskytuje kojenci dostatek času k dosažení rovnovážného stavu se stabilním izotopem 1-13CPfenylalaninu nad výchozími hodnotami, jak bylo stanoveno našimi parenterálními studiemi u kojenců (Chapman 2009, 2010). První dvě studie provedeme pouze s použitím stabilního izotopu fenylalaninu. Pokud při analýze zjistíme, že nevidíme dostatečný rozdíl mezi základními a ustálenými hladinami stabilního izotopu 1-13CPfenylalanin, pak zavedeme jednorázovou dávku 13C-hydrogenuhličitanu sodného (NaH13CO2) v množství 14 μmol kg- 1 podávané sondou NG/G, abychom mohli vidět rozdíl mezi přirozeně se vyskytujícím 1-13CPfenylalaninem dítěte a množstvím, které podáváme s umělým mlékem. Nevěříme, že budeme muset použít izotop bikarbonátu, ale přidali jsme do našeho protokolu ke schválení, pokud by jeho použití bylo nutné. Je rutinně používán skupinou vědců v Nizozemsku, kteří také studují požadavky na aminokyseliny u kojenců a kteří nehlásili žádné problémy s jeho podáváním (Hogewind-Schoonenboom 2014).

Stabilní izotopové indikátory jsou označeny „For Research Use Only“ a jsou přijatelné pro použití u lidí všech věkových kategorií, což bude potvrzeno společností vyrábějící izotopy, která poskytne Certifikát analýzy s testováním chemické čistoty, případně přítomnosti těžké kovy (v částech na milion) a mikrobiologické testování včetně pyrogenů. Oba izotopy budou připraveny ve stravovací kuchyni nemocnice v době přípravy studijního vzorce podle stejných pokynů SOP jako klinické diety.

Sběr a analýza vzorků

Budou odebírány vzorky dechu a moči, aby se určily změny v reakci kojenců na studijní dietu. Před zavedením studijní diety budou odebrány tři základní vzorky dechu a moči. Každou hodinu budou odebírány čtyři vzorky dechu a moči v plošině počínaje 12-18 hodinami po zavedení stabilních izotopů značených indikátorů stupně pro výzkum. Vzorky dechu budou odebírány pomocí analyzátoru oxidu uhličitého Cart, který má podobný design a použití jako klinické testovací zařízení zvané kalorimetr. Obě zařízení využívají systém odvětrávané kapuce, pod kterou kojenci spí nebo odpočívají, a měří se VCO2. Každý vzorek dechu bude shromažďován po dobu 10 minut probubláváním výdechového proudu do zpětného chladiče a zachycením dechu do zkumavky. Vzorky dechu budou měřeny hmotnostním spektrometrem s poměrem izotopů s kontinuálním průtokem. Vzorky moči budou odebírány umístěním vatových tamponů do dětských plen a analyzovány na tandemovém hmotnostním spektrometru.

Statistická analýza

Vliv příjmu threoninu na tok fenylalaninu, oxidaci a F13CO2 bude testován pomocí analýzy rozptylu s postupem PROC GLM (SAS verze 9.4). Odhady průměrného příjmu threoninu budou odvozeny analýzou zlomových bodů rychlosti uvolňování 13CO2 (F13CO2) s použitím 2fázového lineárního regresního crossover modelu. Bod zlomu bude vypočítán pomocí smíšených modelů a regresní procedury SAS, přičemž směrnice přímky se nebude významně lišit od nuly. Statistická významnost bude stanovena na P< 0,05.

Proměnnými regresní analýzy jsou threonin jako nezávislá proměnná a F13CO2 a oxidace fenylalaninu jako závislé proměnné. Výběr nejlepšího modelu bude určen faktory týkajícími se shody (významnost modelu a r2) a odhady variací o modelu (CV a SE odhadu). Doporučená dietní dávka populace bude odhadnuta stanovením horních 95% mezí spolehlivosti odhadu bodu zlomu.