确定 1 至 6 个月婴儿肠内苏氨酸需求的生理学研究 (INFORALTHR)

介绍

苏氨酸是一种不可或缺的 AA，必须来自饮食来源。 它对肠道粘蛋白的产生至关重要（Law、Bertolo 等人，2007 年），并显着促进胶原蛋白、弹性蛋白和牙釉质的形成（Kramsch、Franzblau 等人，1971 年；Robinson、Lowe 等人，1975 年）。 由于缺乏确凿的经验数据，医学、食品和营养委员会在 2005 年常量营养素膳食参考摄入量 (DRI) 中提出的当前婴儿苏氨酸的充足摄入量 (AI) 是基于析因方法。 导致确定婴儿氨基酸 (AA) 需求的研究使用了氮分析技术，并且是在 20 多年前进行的 (Snyderman, Norton et al. 1959)。 方法学的进步使得用更精确的技术确定人体对 AA 的需求成为可能（Zello、Wykes 等人，1995 年）。 然而，没有关于使用较新的稳定同位素方法对婴儿（1-6 个月大）苏氨酸需求的研究的报道。

为准确确定氨基酸需求量，有必要提供氨基酸摄入量范围。 出于伦理原因，婴儿不能长时间喂食非常低或高测试氨基酸的饮食。 微创 IAAO 方法最初在我们实验室的成人中开发（Zello、Pencharz 等人，1993 年），现在在国际上使用（Huang、Hogewind-Schoonenboom 等人，2011 年）来确定氨基酸需求，克服了这个问题。 IAAO 方法的实施时间不到 24 小时，已安全地用于肠胃外喂养的新生儿、肠内喂养的新生儿、儿童和成人。

我们的实验室确定了仔猪的肠内苏氨酸需求量（Bertolo，Chen 等人，1998 年）为 0.42 克/千克/天。 我们能够从这些数据中推断出，并建议新生儿的肠内需求量为 84 mg/kg/d。 在这项研究中，我们将确定 1 - 6 个月大婴儿的肠内需求，并预测由于出生后第一个月后生长减慢和蛋白质需求减少，婴儿的肠内需求将类似于 DRI 的 AI 73 mg /公斤/天。 因此，本研究的目的是使用 IAAO 方法确定 1 至 6 个月大婴儿的肠内苏氨酸需求量。

主题和方法

受试者：总共将进行 18 项研究，参与者将被随机分配到 18 种测试苏氨酸摄入量中的 1 种。 将从加拿大多伦多病童医院 (SickKids) 的住院术后人群中招募 1 至 6 个月大的婴儿。 参与者可能有资格在注册后参加不止一项研究摄入，因此被随机分配到第二次苏氨酸摄入。 所有研究程序和同意书都将获得 SickKids 研究伦理委员会的批准。 将从主治外科医生处获得将婴儿纳入研究的许可，并从父母/监护人之一或双方获得书面知情同意书。 患者招募预计将于 2015 年 12 月开始。 该研究已在 clinicaltrials.gov 注册 #NCT02364843。

如果婴儿年龄在 1 至 6 个月之间，出生胎龄在 32 周至 43 周之间，根据正常血液值和生命体征确定临床稳定，并且是住院患者，则婴儿将被纳入研究通过鼻胃管 (NG-)、空肠管 (NJ- 或 J-) 或胃管 (G-) 进食。 如果婴儿正在接受补充氧气、机械通气、有任何会影响蛋白质和 AA 代谢的内分泌或遗传异常，或正在接受会影响蛋白质和 AA 代谢的药物（例如 皮质类固醇治疗）。

实验设计和研究饮食

该研究设计是微创 IAAO 设计，其基于的概念是，由于 AA 不会储存在体内，因此相对于其用于蛋白质合成的膳食必需 AA 的摄入量决定了它们是被氧化还是被掺入蛋白质中。 当一种不可或缺的 AA 的摄入量受到限制时，其他不可或缺的 AA 就会过量并被氧化，因为它们无法如前所述融入蛋白质中（Zello，Pencharz 等人，1993 年）。 每项研究将在婴儿的临床营养师确认在研究日之前的 24 至 48 小时内从婴儿的饲料中摄入适当的蛋白质和非蛋白质能量后进行 18 - 24 小时。 在一个研究日（持续时间少于 24 小时；见图 1），婴儿将接受由商业无蛋白肠内配方（Pro-Phree）制成的配方，该配方提供已知量的碳水化合物、脂肪、适合婴儿的矿物质、微量元素和维生素，并将添加 AA 混合物。 氨基酸在母乳中的添加比例为mg·kg-1·d-1：Lys 207、Met 48、Leu 288、Ile 165、Val 165、Phe 126、Try 51、His 63、Tyr 156 , Arg 69, Pro 240, Cys 51, Gly 69, Ala 114, Ser 150, Asp 270, Glu 534 (WHO 2007)。 每名婴儿将在每项研究中接受不同的苏氨酸摄入量，18 名婴儿的 18 次摄入量将落在 15 至 130 mg·kg-1·d-1 之间的连续区间内。 由于苏氨酸的摄入量不同，配方将通过改变丙氨酸（一种可有可无的 AA）的摄入量来保持等氮。 氨基酸混合物将通过 0.22 µ 过滤器，以确保其无菌且无病原体。 这是一个额外的安全步骤，在研究肠胃外喂养婴儿的苏氨酸和赖氨酸需求时，商业配方奶粉没有这样做，但我们的肠外溶液已完成（Chapman 2009，2010）。 结合 AA 混合物和商业制备的 Pro-Phree 配方将在医院的配方室根据临床配方制备的标准操作程序 (SOP) 指南进行。 婴儿将按照临床营养师的要求，在 18-24 小时的研究期内通过喂食管或管饲和口腔喂养的组合接受研究配方奶粉。

由美国缅因州剑桥同位素实验室 (CIL) 制造的研究级稳定同位素示踪剂将用于测量氧化或蛋白质沉积，以响应不同的苏氨酸摄入量。 稳定同位素是一种氨基酸 L-[1-13C] 苯丙氨酸，以 15 µ·kg-1/h-1 的剂量与婴儿饲料一起服用。 这种稳定同位素存在于所有人类中，占氨基酸苯丙氨酸总百分比的 1%，并且稳定同位素本身在多伦多病童医院进行的 4 项先前研究中成功地用于婴儿静脉注射时没有伤害加拿大（Roberts 2001；Courtney Martin 2008；Chapman 2009、2010）。

我们使用的研究方案可为婴儿提供足够的时间，使稳定的 1-13CP 苯丙氨酸同位素高于我们的婴儿肠胃外研究确定的基线值 (Chapman 2009, 2010)。 我们将仅使用苯丙氨酸稳定同位素进行前两项研究。 如果在分析中，我们发现 1-13C 苯丙氨酸稳定同位素的基线水平和稳态水平之间没有足够的差异，那么我们将引入一次性剂量的 13C-碳酸氢钠 (NaH13CO2)，剂量为 14 μmol kg- 1 由 NG/G 管给药，使我们能够看到婴儿天然存在的 1-13C 苯丙氨酸与我们用配方奶给药的量之间的区别。 我们认为我们不需要使用碳酸氢盐同位素，但如果有必要使用它，我们已将其添加到我们的协议中以供批准。 它被荷兰的一组科学家常规使用，他们还研究婴儿氨基酸需求并且没有报告任何管理问题（Hogewind-Schoonenboom 2014）

稳定同位素示踪剂标记为“仅供研究使用”，可用于所有年龄段的人类，这将由同位素制造公司确认，同位素制造公司将提供分析证书，测试化学纯度、存在（如果有）重金属（百万分之一）和微生物测试，包括热原。 在制备研究配方时，将根据与临床饮食相同的 SOP 指南，在医院的 Diet Kitchen 中制备这两种同位素。

样品采集和分析

将收集呼吸样本和尿液以确定婴儿对研究饮食反应的变化。 在引入研究饮食之前，将收集三个基线呼吸和尿液样本。 在引入研究级稳定同位素标记示踪剂后的 12-18 小时内，每小时将收集四个高原呼吸和尿液样本。 呼吸样本将使用二氧化碳分析仪小车收集，该小车在设计和用途上与称为热量计的临床测试设备相似。 两种设备都使用通风罩系统，婴儿在该系统下睡觉或休息并测量 VCO2。 通过将呼吸流出物鼓泡进入回流冷凝器并将呼吸收集在试管中，将在 10 分钟内收集每个呼吸样本。 呼吸样本将通过连续流动同位素比质谱仪进行测量。 通过将棉球放在婴儿尿布中收集尿液样本，并在串联质谱仪上进行分析。

统计分析

苏氨酸摄入量对苯丙氨酸通量、氧化和 F13CO2 的影响将通过使用 PROC GLM 程序（SAS 版本 9.4）的方差分析来测试。 平均苏氨酸摄入量的估计值将通过使用 2 相线性回归交叉模型对 13CO2 (F13CO2) 数据的释放速率进行断点分析得出。 将使用 SAS 的混合模型和回归程序计算断点，直线的斜率与零没有显着差异。 统计显着性将确定为 P<0.05。

回归分析变量以苏氨酸为自变量，F13CO2和苯丙氨酸氧化为因变量。 最佳模型的选择将取决于与拟合相关的因素（模型的重要性和 r2）和模型变异的估计（估计的 CV 和 SE）。 将通过确定断点估计值的 95% 置信上限来估计人群推荐膳食允许量。