T2DMにおける身体運動と栄養カウンセリングの機能としてのミトコンドリア代謝と酸化ストレス (MITOX)

介入なし：ND-非活性

栄養介入または運動プログラムのいずれも受けなかった参加者。 彼らは身体活動と食事に関する通常の生活習慣を維持するように指示されました。

アクティブコンパレータ：中強度連続トレーニング (ND-MICT)

栄養介入を受けなかったが、中等度強度連続トレーニング運動プログラムに登録された参加者。

他の：中強度連続トレーニング（MICT）

MICT群に割り当てられた参加者は、12週間にわたり自転車エルゴメーターを用いて週3回のセッションを完了し、セッション間に1～2日の休養を挟みました。

MICTは、乳酸閾値の約10%上の強度で60～80 rpmのケイデンスで50分間の連続ペダリングで構成されました。トレーニング負荷（TL）は、以下の2つの条件が満たされた場合に10％増加させました：1）トレーニングセッションの20分目から40分目にかけて心拍数が少なくとも2拍以上増加しないこと、2）セッションの48分目における乳酸値が2 mmol/L未満であること。初回セッションのTLは、調整テストによって決定されました。このテストは、以前に行われたFatOxテストデータから計算された換気性閾値パワーの90%から130%まで、各ステップで10%ずつ増加させた一定のケイデンス（60～80 RPM）での連続する5つの10分間フェーズからなる増加テストで構成されました。TLは、フェーズ間でHRが≥3拍増加し、血中乳酸レベルが前のフェーズから≥1 mmol/L増加したフェーズによって決定されました。

アクティブコンパレータ：高強度インターバルトレーニング（ND-HIIT）

栄養介入を受けなかったが、高強度インターバルトレーニング運動プログラムに登録された参加者。

他の：高強度インターバルトレーニング（HIIT）

HIIT群に割り付けられた参加者は、週3回のセッションを自転車エルゴメーターで12週間実施し、各セッション間に1～2日の休息を挟みました。

トレーニング負荷（TL）は、以前に行ったVO2maxテストの最大パワー出力（Wmax）から85％から165％まで（10％刻み）の1分間の作業インターバルと、1.5分間の休息期間（20％Wmax）を交互に繰り返し、自発的疲労まで実施した増分テストから決定されました。

プログラムは、TLの20％で2分間、TLの40％で1分間の合計3分間のウォームアップから始まり、その後、TLの90％で1分間のインターバルを10セット実施し、セット間はTLの40％で1分間休息し、最後にTLの20％で2分間のクールダウンで終了しました（セッションの推定総時間：25分）。 連続する2回のセッションで、最初の3回のインターバルが最大心拍数の85％を超えず、最後の5回のインターバルが最大心拍数の90％に達しなかった場合、作業負荷を5％増加させました。 参加者はケイデンスを80RPM以上に維持するよう求められました。

アクティブコンパレータ：栄養介入（D-INACT）

栄養介入を受けたが運動プログラムを受けなかった参加者。

行動：Nutritional intervention

The nutritional intervention was conducted through biweekly (± 3 days) in-person consultations with a nutritionist or dietitian. Firstly, the patient's diet was analyzed. Then, participants were guided to follow a mildly calorie-restricted diet (-250-500 kcal/day deficit), with the primary goal of achieving a 5 % reduction in body weight and reducing blood glucose levels. Meal plans were created using Nutrium® software , personalized to each participant's lifestyle and food preferences, and reviewed at each biweekly consultation. The dietary plan included at least 4 or 5 meals per day, ensuring a well-distributed intake of carbohydrates, a balanced distribution of macro- and micronutrients, and the inclusion of foods rich in prebiotics and probiotics. Moreover, some suggestions about the combination of foods and culinary techniques were provided. Only one session through the intervention was allowed to be attended telephonically.

実験的：栄養介入中強度持続トレーニング（D-MICT）

栄養介入を受け、中等度強度連続トレーニング運動プログラムに参加した参加者。

他の：中強度連続トレーニング（MICT）

MICT群に割り当てられた参加者は、12週間にわたり自転車エルゴメーターを用いて週3回のセッションを完了し、セッション間に1～2日の休養を挟みました。

MICTは、乳酸閾値の約10%上の強度で60～80 rpmのケイデンスで50分間の連続ペダリングで構成されました。トレーニング負荷（TL）は、以下の2つの条件が満たされた場合に10％増加させました：1）トレーニングセッションの20分目から40分目にかけて心拍数が少なくとも2拍以上増加しないこと、2）セッションの48分目における乳酸値が2 mmol/L未満であること。初回セッションのTLは、調整テストによって決定されました。このテストは、以前に行われたFatOxテストデータから計算された換気性閾値パワーの90%から130%まで、各ステップで10%ずつ増加させた一定のケイデンス（60～80 RPM）での連続する5つの10分間フェーズからなる増加テストで構成されました。TLは、フェーズ間でHRが≥3拍増加し、血中乳酸レベルが前のフェーズから≥1 mmol/L増加したフェーズによって決定されました。

行動：Nutritional intervention

The nutritional intervention was conducted through biweekly (± 3 days) in-person consultations with a nutritionist or dietitian. Firstly, the patient's diet was analyzed. Then, participants were guided to follow a mildly calorie-restricted diet (-250-500 kcal/day deficit), with the primary goal of achieving a 5 % reduction in body weight and reducing blood glucose levels. Meal plans were created using Nutrium® software , personalized to each participant's lifestyle and food preferences, and reviewed at each biweekly consultation. The dietary plan included at least 4 or 5 meals per day, ensuring a well-distributed intake of carbohydrates, a balanced distribution of macro- and micronutrients, and the inclusion of foods rich in prebiotics and probiotics. Moreover, some suggestions about the combination of foods and culinary techniques were provided. Only one session through the intervention was allowed to be attended telephonically.

実験的：栄養介入 高強度インターバルトレーニング（D-HIIT）

栄養介入を受け、高強度インターバルトレーニング運動プログラムに参加した参加者。

他の：高強度インターバルトレーニング（HIIT）

HIIT群に割り付けられた参加者は、週3回のセッションを自転車エルゴメーターで12週間実施し、各セッション間に1～2日の休息を挟みました。

トレーニング負荷（TL）は、以前に行ったVO2maxテストの最大パワー出力（Wmax）から85％から165％まで（10％刻み）の1分間の作業インターバルと、1.5分間の休息期間（20％Wmax）を交互に繰り返し、自発的疲労まで実施した増分テストから決定されました。

プログラムは、TLの20％で2分間、TLの40％で1分間の合計3分間のウォームアップから始まり、その後、TLの90％で1分間のインターバルを10セット実施し、セット間はTLの40％で1分間休息し、最後にTLの20％で2分間のクールダウンで終了しました（セッションの推定総時間：25分）。 連続する2回のセッションで、最初の3回のインターバルが最大心拍数の85％を超えず、最後の5回のインターバルが最大心拍数の90％に達しなかった場合、作業負荷を5％増加させました。 参加者はケイデンスを80RPM以上に維持するよう求められました。

行動：Nutritional intervention

The nutritional intervention was conducted through biweekly (± 3 days) in-person consultations with a nutritionist or dietitian. Firstly, the patient's diet was analyzed. Then, participants were guided to follow a mildly calorie-restricted diet (-250-500 kcal/day deficit), with the primary goal of achieving a 5 % reduction in body weight and reducing blood glucose levels. Meal plans were created using Nutrium® software , personalized to each participant's lifestyle and food preferences, and reviewed at each biweekly consultation. The dietary plan included at least 4 or 5 meals per day, ensuring a well-distributed intake of carbohydrates, a balanced distribution of macro- and micronutrients, and the inclusion of foods rich in prebiotics and probiotics. Moreover, some suggestions about the combination of foods and culinary techniques were provided. Only one session through the intervention was allowed to be attended telephonically.

筋生検サンプル：ミトコンドリア呼吸能力

皮膚に局所麻酔を施し、皮膚表面に約6〜7mmの切開を行った。滅菌済みのベルグストローム針を用いて、外側広筋から約3〜6mgの骨格筋を採取し、高解像度呼吸測定法によるミトコンドリア呼吸（MR）の即時分析のためにBIOPS緩衝液に移した。これに先立ち、BIOPS緩衝液中で滅菌針を用いて線維を機械的に分離し、50μg/mlサポニン溶液で化学的に透過化処理した。

MRは、特定の緩衝液（Mir05）中で、37℃のOxygraph-2k（オロボロス、インスブルック、オーストリア）の過酸素化チャンバー（酸素濃度250-450mM）において、二重測定で評価した。基質-脱共役剤滴定プロトコルを採用し、最終濃度として以下を添加した：マラート（2mM）、ピルビン酸（5mM）、グルタミン酸（2mM）、MgCl2（3mM）、ADP（5mM）、シトクロムC（10μM）、コハク酸（10mM）、p-トリフルオロメトキシフェニルヒドラゾン。酸素フラックスは質量特異的（pmol・s/mg湿重量）で示され、CS活性に対して正規化された。

酸化ストレスの変化を評価

酸化ストレスのレベルは、DNA酸化のバイオマーカーとして8-OHdGの濃度によって評価されました。 血清サンプルでは競合ELISA検出法が採用されました。 簡潔に言うと、標準液とサンプルを予めコーティングされたマイクロプレートに、ビオチン化検出抗体とともに添加しました。 洗浄後、HRP-ストレプトアビジンを添加しました。 その後、TMB基質を添加し、反応は酸溶液で停止させました。 発色は分光光度計を用いて450nmの波長で測定しました。 サンプルの吸光度値を標準曲線と比較して、8-OHdG濃度（ng/ml）を決定しました。

筋肉生検サンプル: クエン酸シンターゼ活性

凍結筋肉 2-5 mg を、4℃で 1% プロテアーゼ阻害剤カクテル (P8340, Sigma-Aldrich, Dorset, UK) を加えた CelLytic™ MT 組織溶解液 (C3228, Sigma-Aldrich, Dorset, UK) の 1:20 希釈液でホモジナイズした。 ライセートを 4℃で 12,000 × g、10 分間遠心分離し、デブリをペレット化し、上清を -80℃で保存した。 CS 活性は、製造元の指示に従いアッセイキット (CS0720: Sigma-Aldrich, Dorset, UK) を用いて複数回測定した。 簡潔に言うと、内因性活性は DTNB による発色で記録され、オキサロ酢酸添加後の総活性が計算された。 タンパク質濃度は、ビシンコニン酸アッセイキット (BCA1: Sigma-Aldrich, Dorset, UK) を用いて複数回測定し、CS 活性値を総タンパク質含量 (μmol/g/min) で正規化した。 CS 活性とタンパク質濃度は、それぞれ 412 nm と 562 nm でマイクロプレートリーダー (MQX200R2, Biotek instruments, Burlington, USA) を用いて 96 ウェルプレートで測定された。

Assessed changes in haemoglobin saturation delta

A NIRO-200NX device was used to measure skeletal muscle changes on oxygenated, desoxygenated, and total haemoglobin (μmol/L) through near-infrared spectroscopy (NIRS) and the modified Beer-Lambert law. The NIRS sensor (emitter-sensor distance of 3cm) was placed at 2/3 of the distance between the major trochanter and the lateral epicondyle of the dominant leg. For parameters determined by MBLL, the reference point was set after five minutes of resting in a supine position. The NIRS data were continuously acquired throughout a resting energy expenditure test for 30 minutes, a maximal fat oxidation (MFO) test on a cycloergometer, and a maximal oxygen consumption (VO2max) test on a cycloergometer. Briefly, the MFO test consisted of an incremental task with 3-minute phases starting from 15W and increasing by 15W each phase until a respiratory exchange ratio of 1. After a 5-minute rest, the VO2max test was initiated at last MFO load with 15W increases each minute until VO2max determination.

Assessed changes in Tissue Oxygenation Index

A NIRO-200NX device was used to measure skeletal muscle tissue oxygenation index (%)through near-infrared spectroscopy (NIRS), the modified Beer-Lambert law (MBLL), and spatially resolved spectroscopy. The NIRS sensor (emitter-sensor distance of 3cm) was placed at 2/3 of the distance between the major trochanter and the lateral epicondyle of the dominant leg. For parameters determined by MBLL, the reference point was set after five minutes of resting in a supine position. The NIRS data were continuously acquired throughout a resting energy expenditure test for 30 minutes, a maximal fat oxidation (MFO) test on a cycloergometer, and a maximal oxygen consumption (VO2max) test on a cycloergometer. Briefly, the MFO test consisted of an incremental task with 3-minute phases starting from 15W and increasing by 15W each phase until a respiratory exchange ratio of 1. After a 5-minute rest, the VO2max test was initiated at last MFO load with 15W increases each minute until VO2max determination.

グルコース濃度の変化の評価

グルコース濃度（mg/dL）は、少なくとも8時間の絶食後、および75グラムのグルコース（Nuter-tec、75 g/200 mL、オレンジ風味）摂取後30、60、90、120、および180分に肘正中静脈から採取した血液サンプルから測定されました。 参加者には、検査前日に通常の生活習慣を維持し、24時間アルコールまたはカフェインの摂取を控え、72時間激しい身体活動を避けるよう指示されました。 血液サンプルは4000 rpmで7分間遠心分離され、血清が分析されました。 グルコース濃度は、Alinity CIシステム（アボット・ラボラトリーズ、アボットパーク、イリノイ州、米国）で実施された比色法を用いて測定されました。

インスリン濃度の評価された変化

インスリン濃度（μU/mL）は、少なくとも8時間の絶食後、および75グラムのグルコース（Nuter-tec、75 g/200 mL、オレンジ風味）摂取後30、60、90、120、180分に肘正中静脈から採血した血液を血清分離管に採取し測定しました。 参加者には検査前日に、通常の生活習慣を維持し、24時間アルコールまたはカフェイン摂取を控え、72時間激しい身体活動を避けるよう指示されました。 血液サンプルは4000 rpmで7分間遠心分離し、血清を分析しました。 インスリン濃度は、Alinity CIシステム（Abbott Laboratories、Abbott Park、IL、USA）で実施された化学発光免疫測定法により決定されました。

インスリン抵抗性の変化を評価：HOMA-IR

インスリン抵抗性は、恒常性モデル評価によるインスリン抵抗性（HOMA-IR）を用いて推定され、空腹時インスリン（μU/mL）に空腹時血糖（mg/dL）を乗じ、405で除算して算出された。

インスリン感受性の変化を評価: 松田指数

全身のインスリン感受性は、松田指数を用いて推定され、10,000／√[（空腹時血糖値（mg/dL）×空腹時インスリン値（µU/mL））×（経口ブドウ糖負荷試験中の平均血糖値（mg/dL）×経口ブドウ糖負荷試験中の平均インスリン値（µU/mL））]として計算されました。

インスリン感受性の変化の評価：Quicki

インスリン感受性は、定量的インスリン感受性チェック指数（QUICKI）を通じて推定され、1 ÷ [log（空腹時インスリン（µU/mL）） + log（空腹時血糖（mg/dL））]として計算されました。

体重の変化を評価

体重（キログラム、kg）は、少なくとも8時間の絶食後、多周波生体電気インピーダンス装置（TANITA-MC780MA、タニタ株式会社、東京、日本）を使用して測定されました。 参加者は、検査前日に通常の生活を維持し、24時間アルコールやカフェインを控え、72時間激しい身体活動を避けるよう指示されました。 参加者は軽装で、測定直前に排尿するよう求められました。

体格指数（BMI）の評価された変化

ボディマス指数（BMI）は、体重（kg）を身長の2乗（m²）で割って計算され、単位はキログラム毎平方メートル（kg/m²）です。

脂肪量（キログラム）の変化を評価

脂肪量（キログラム、kg）は、少なくとも8時間の絶食後、8電極デバイス（TANITA-MC780MA、タニタ株式会社、東京、日本）を使用した多周波生体電気インピーダンス法で推定されました。 参加者は、検査前日に通常の生活を維持し、24時間アルコールやカフェインを控え、72時間激しい身体活動を避けるように指示されました。 参加者は軽装で、測定直前に排尿するように求められました。

脂肪量の変化（脂肪量の割合）を評価した

脂肪量（全体重における割合、％）は、8時間以上の絶食後に、8電極式多周波生体電気インピーダンス装置（TANITA-MC780MA、タニタ株式会社、東京、日本）を用いて推定されました。 参加者には、検査前日に通常の生活を維持し、24時間アルコールまたはカフェインを控え、72時間激しい身体活動を避けるように指示されました。 参加者は軽装で、測定直前に排尿するよう求められました。

脂肪除体重（キログラムの脂肪除体重）の変化を評価

除脂肪体重（キログラム、kg）は、少なくとも8時間の絶食後、8電極デバイス（TANITA-MC780MA、タニタ株式会社、東京、日本）を用いた多周波生体電気インピーダンス法により推定されました。 参加者は、検査前日に日常生活を維持し、24時間アルコールやカフェインを控え、72時間激しい身体活動を避けるよう指示されました。 参加者は軽装で、測定直前に排尿するよう求められました。

脂肪除去体重の変化を評価（脂肪除去体重の割合）

除脂肪体重（全体重に対する割合、％）は、8時間以上の絶食後に多周波生体電気インピーダンス法を用いて8電極装置（TANITA-MC780MA、タニタ株式会社、東京、日本）で推定されました。 参加者は、検査前日に通常の生活習慣を維持し、24時間アルコールまたはカフェインを控え、72時間激しい身体活動を避けるよう指示されました。 参加者は軽装で、測定直前に排尿するよう依頼されました。

人体測定の変化を評価：周囲径

ウエスト周囲長(cm)は、第10肋骨の下外側縁と腸骨稜の中間点で、体幹の長軸に垂直に測定した。 腹囲(cm)は、臍の高さで、体幹の長軸に垂直に測定した。 ヒップ周囲長(cm)は、殿部の最も後方に突出した部分の高さで、体幹の長軸に垂直に測定した。 大腿周囲長(cm)は、大転子と脛骨外側顆の中間点で測定した。 すべての測定は、参加者が直立し、リラックスした状態で実施した。 各測定は2回行い、差が1％を超えた場合は3回目の測定を実施した。 最も近い2回の記録の平均値を登録した。

評価された人体測定の変化：ウエストヒップ比

ウエストヒップ比（WHR）は、ウエスト周囲径（cm）をヒップ周囲径（cm）で割って算出した。

評価された身体測定の変化：皮下脂肪厚

大腿部の皮脂厚は、上前腸骨棘の最下部（腸骨棘点）から膝蓋骨の外側上縁までの距離の3分の2の位置で、外側広筋の筋腹上で測定した。測定は利き足で行った。2回測定し、最初の2回の差が5％を超えた場合は3回目を測定した。最も類似した2回の記録の平均値を記録した。

体組成の変化の評価：脂肪量と除脂肪量。

身体組成は、事前に検証された8電極多周波生体インピーダンス法（TANITA-MC780MA、タニタ株式会社、東京、日本）を用いて推定され、少なくとも8時間の絶食、および前日に以下の注意事項を守った状態で実施されました：1）通常の生活習慣を維持する、2）24時間アルコールまたはカフェインの摂取を控える、3）測定の72時間前から激しい身体活動を避ける。
さらに、参加者は測定直前に排尿するよう指示されました。

患者は軽装で、メーカーの指示に従った姿勢をとりました。

さらに、同じ装置を用いた体重と壁掛け身長計（TANITA-LEICESTER HR-001、タニタ株式会社、東京、日本）による身長を測定し、体格指数を計算しました。

評価身長

身長（メートル、m）は、壁取り付け式身長計（TANITA-LEICESTER HR-001、株式会社タニタ、東京都）を使用して測定され、参加者は製造元の指示に従って立位姿勢をとりました。