Mitochondriální metabolismus a oxidační stres ve funkci fyzického cvičení a nutričního poradenství u T2DM (MITOX)

Žádný zásah: ND-NEAKTIVNÍ

Účastníci, kteří neobdrželi ani nutriční intervenci, ani cvičební program. Bylo jim nařízeno zachovat si své běžné životní návyky týkající se fyzické aktivity a stravy.

Aktivní komparátor: Trénink střední intenzity s nepřetržitým zatížením (ND-MICT)

Účastníci, kteří neobdrželi nutriční intervenci, ale byli zařazeni do programu cvičení s mírnou intenzitou a kontinuálním tréninkem.

Jiný: Trénink střední intenzity s nepřetržitým zatížením (MICT)

Účastníci zařazení do skupiny MICT absolvovali 3 týdenní tréninkové jednotky s 1–2 dny odpočinku mezi jednotkami na cyklistickém ergometru po dobu 12 týdnů.

MICT sestával z 50 minut kontinuálního šlapání při intenzitě přibližně 10 % nad laktátovým prahem s kadencí mezi 60–80 ot./min. Tréninková zátěž (TL) byla zvýšena o 10 %, pokud byly splněny tyto dvě podmínky: 1) žádné zvýšení srdeční frekvence o alespoň 2 údery od 20. do 40. minuty tréninkové jednotky a 2) hladiny laktátu pod 2 mmol/l ve 48. minutě jednotky. TL pro první tréninkovou jednotku byla stanovena pomocí adjustačního testu sestávajícího z inkrementálního testu s pěti po sobě jdoucími 10minutovými fázemi při konstantní kadencji (60–80 ot./min) od 90 % do 130 % výkonu ventilačního prahu, vypočteného z dříve provedených údajů testu FatOx, s 10% přírůstky v každém kroku. TL byla stanovena fází, ve které se SF zvýšila o ≥ 3 údery mezi fázemi a hladiny laktátu v krvi vzrostly o ≥ 1 mmol/l oproti předchozí fázi.

Aktivní komparátor: Vysoko intenzivní intervalový trénink (ND-HIIT)

Účastníci, kteří neobdrželi nutriční intervenci, ale byli zařazeni do vysoce intenzivního intervalového tréninkového cvičebního programu.

Jiný: Vysokointenzivní intervalový trénink (HIIT)

Účastníci přiřazení k HIIT absolvovali 3 týdenní sezení s 1-2 dny odpočinku mezi sezeními na cyklistickém ergometru po dobu 12 týdnů.

Tréninková zátěž (TL) byla stanovena z přírůstkového testu do dobrovolného vyčerpání s jednominutovými pracovními intervaly (od 85 % do 165 % maximálního výkonu z dříve provedeného VO2max testu [Wmax] a s 10% přírůstky) oddělenými 1,5minutovými obdobími odpočinku (při 20 % Wmax).

Program se skládal z 3minutového zahřátí s prvními 2 minutami na 20 % a poslední minutou na 40 % TL, následovaného 10 sériemi trvajícími 1 minutu při 90 % TL, s 1 minutou odpočinku mezi sériemi při 40 % TL a zakončeného 2minutovým zklidněním při 20 % TL (odhadovaná celková doba sezení: 25 minut). Ke zvýšení zátěže o 5 % došlo, když u dvou po sobě jdoucích sezení první tři intervaly nepřekročily 85 % a posledních pět nedosáhlo 90 % maximální TF. Účastníci byli požádáni, aby udržovali kadenci nad 80 ot./min.

Aktivní komparátor: Nutriční intervence (D-INACT)

Účastníci, kteří obdrželi nutriční intervenci, ale nikoli cvičební program.

Behaviorální: Nutriční intervence

Výživová intervence byla prováděna prostřednictvím osobních konzultací s výživovým poradcem nebo dietologem každé dva týdny (± 3 dny) po celou dobu 12 týdnů. Nejprve byla analyzována pacientova strava. Poté byli účastníci vedeni k dodržování středomořského vzoru stravování a mírně kaloricky omezené stravy, s primárním cílem dosáhnout 5% snížení tělesné hmotnosti a snížení hladiny glukózy v krvi. Jídelní plány byly vytvářeny pomocí softwaru Nutrium®, přizpůsobené životnímu stylu a stravovacím preferencím každého účastníka a revidovány při každé dvoutýdenní konzultaci. Dietní plán zahrnoval alespoň 4 jídla denně, zajišťující dobře rozložený příjem sacharidů, vyvážené rozložení makro- a mikroživin a zařazení potravin bohatých na prebiotika a probiotika. Kromě toho byly poskytnuty některé návrhy ohledně kombinace potravin a kulinářských technik. Pouze jedna konzultace během intervence mohla být absolvována telefonicky.

Experimentální: Nutriční intervence Středně intenzivní kontinuální trénink (D-MICT)

Účastníci, kteří obdrželi nutriční intervenci a byli zařazeni do programu cvičení s mírnou intenzitou kontinuálního tréninku.

Jiný: Trénink střední intenzity s nepřetržitým zatížením (MICT)

Účastníci zařazení do skupiny MICT absolvovali 3 týdenní tréninkové jednotky s 1–2 dny odpočinku mezi jednotkami na cyklistickém ergometru po dobu 12 týdnů.

MICT sestával z 50 minut kontinuálního šlapání při intenzitě přibližně 10 % nad laktátovým prahem s kadencí mezi 60–80 ot./min. Tréninková zátěž (TL) byla zvýšena o 10 %, pokud byly splněny tyto dvě podmínky: 1) žádné zvýšení srdeční frekvence o alespoň 2 údery od 20. do 40. minuty tréninkové jednotky a 2) hladiny laktátu pod 2 mmol/l ve 48. minutě jednotky. TL pro první tréninkovou jednotku byla stanovena pomocí adjustačního testu sestávajícího z inkrementálního testu s pěti po sobě jdoucími 10minutovými fázemi při konstantní kadencji (60–80 ot./min) od 90 % do 130 % výkonu ventilačního prahu, vypočteného z dříve provedených údajů testu FatOx, s 10% přírůstky v každém kroku. TL byla stanovena fází, ve které se SF zvýšila o ≥ 3 údery mezi fázemi a hladiny laktátu v krvi vzrostly o ≥ 1 mmol/l oproti předchozí fázi.

Behaviorální: Nutriční intervence

Výživová intervence byla prováděna prostřednictvím osobních konzultací s výživovým poradcem nebo dietologem každé dva týdny (± 3 dny) po celou dobu 12 týdnů. Nejprve byla analyzována pacientova strava. Poté byli účastníci vedeni k dodržování středomořského vzoru stravování a mírně kaloricky omezené stravy, s primárním cílem dosáhnout 5% snížení tělesné hmotnosti a snížení hladiny glukózy v krvi. Jídelní plány byly vytvářeny pomocí softwaru Nutrium®, přizpůsobené životnímu stylu a stravovacím preferencím každého účastníka a revidovány při každé dvoutýdenní konzultaci. Dietní plán zahrnoval alespoň 4 jídla denně, zajišťující dobře rozložený příjem sacharidů, vyvážené rozložení makro- a mikroživin a zařazení potravin bohatých na prebiotika a probiotika. Kromě toho byly poskytnuty některé návrhy ohledně kombinace potravin a kulinářských technik. Pouze jedna konzultace během intervence mohla být absolvována telefonicky.

Experimentální: Nutriční intervence Vysokointenzivní intervalový trénink (D-HIIT)

Účastníci, kteří obdrželi nutriční intervenci a byli zařazeni do cvičebního programu s intervalovým tréninkem s vysokou intenzitou.

Jiný: Vysokointenzivní intervalový trénink (HIIT)

Účastníci přiřazení k HIIT absolvovali 3 týdenní sezení s 1-2 dny odpočinku mezi sezeními na cyklistickém ergometru po dobu 12 týdnů.

Tréninková zátěž (TL) byla stanovena z přírůstkového testu do dobrovolného vyčerpání s jednominutovými pracovními intervaly (od 85 % do 165 % maximálního výkonu z dříve provedeného VO2max testu [Wmax] a s 10% přírůstky) oddělenými 1,5minutovými obdobími odpočinku (při 20 % Wmax).

Program se skládal z 3minutového zahřátí s prvními 2 minutami na 20 % a poslední minutou na 40 % TL, následovaného 10 sériemi trvajícími 1 minutu při 90 % TL, s 1 minutou odpočinku mezi sériemi při 40 % TL a zakončeného 2minutovým zklidněním při 20 % TL (odhadovaná celková doba sezení: 25 minut). Ke zvýšení zátěže o 5 % došlo, když u dvou po sobě jdoucích sezení první tři intervaly nepřekročily 85 % a posledních pět nedosáhlo 90 % maximální TF. Účastníci byli požádáni, aby udržovali kadenci nad 80 ot./min.

Behaviorální: Nutriční intervence

Výživová intervence byla prováděna prostřednictvím osobních konzultací s výživovým poradcem nebo dietologem každé dva týdny (± 3 dny) po celou dobu 12 týdnů. Nejprve byla analyzována pacientova strava. Poté byli účastníci vedeni k dodržování středomořského vzoru stravování a mírně kaloricky omezené stravy, s primárním cílem dosáhnout 5% snížení tělesné hmotnosti a snížení hladiny glukózy v krvi. Jídelní plány byly vytvářeny pomocí softwaru Nutrium®, přizpůsobené životnímu stylu a stravovacím preferencím každého účastníka a revidovány při každé dvoutýdenní konzultaci. Dietní plán zahrnoval alespoň 4 jídla denně, zajišťující dobře rozložený příjem sacharidů, vyvážené rozložení makro- a mikroživin a zařazení potravin bohatých na prebiotika a probiotika. Kromě toho byly poskytnuty některé návrhy ohledně kombinace potravin a kulinářských technik. Pouze jedna konzultace během intervence mohla být absolvována telefonicky.

Vzorky svalové biopsie: mitochondriální respirační kapacita

Kůže byla lokálně anestetizována, následně byla provedena incize přibližně 6–7 mm na povrchu dermis. Pomocí sterilizovaných Bergstromových jehel bylo odebráno přibližně 3–6 mg kosterního svalu z laterálního vastu a umístěno do BIOPS pufru pro okamžitou analýzu mitochondriální respirace (MR) pomocí vysokorozlišovací respirometrie. Předtím byla vlákna mechanicky oddělena v BIOPS pufru pomocí sterilizovaných jehel a chemicky permeabilizována roztokem saponinu o koncentraci 50 μg/ml.

MR byla měřena v konkrétním pufru (Mir05) ve zdvojených vzorcích v hyperoxygenovaných komůrkách (250–450 mM kyslíku) v Oxygraph-2k při 37 °C (Oroboros, Innsbruck, Rakousko). Byl použit substrátově-odpřahovací titrační protokol přidáním (konečná koncentrace): malátu (2 mM), pyruvátu (5 mM), glutamátu (2 mM), MgCl2 (3 mM) a ADP (5 mM), cytochromu C (10 μM), sukcinátu (10 mM) a p-trifluormethoxyfenylhydrazonu. Kyslíkový tok byl vyjádřen jako hmotnostně specifický (pmol·s/mg vlhké hmotnosti) a normalizován na aktivitu CS.

Posouzené změny oxidačního stresu

Hladina oxidačního stresu byla hodnocena koncentrací 8-OHdG jako biomarkeru oxidace DNA. K detekci byla použita kompetitivní ELISA metoda v sérových vzorcích. Stručně řečeno, standard a vzorek byly přidány do předem potažené mikrotitrační destičky spolu s biotinylovanou detekční protilátkou. Po promytí byl přidán HRP-Streptavidin. Poté byl přidán TMB substrát a reakce byla zastavena kyselým roztokem. Barevná produkce byla měřena spektrofotometricky při vlnové délce 450 nm. Hodnoty optické hustoty vzorků byly porovnány s hodnotami standardní křivky pro stanovení koncentrace 8-OHdG (ng/ml).

Vzorek svalové biopsie: Aktivita citrát syntázy

2-5 mg zmraženého svalu bylo homogenizováno v 1:20 ředění CelLytic™ MT Tissue Lysis (C3228, Sigma-Aldrich, Dorset, UK) s 1 % koktejlem inhibitorů proteáz (P8340, Sigma-Aldrich, Dorset, UK) při 4 °C. Lyzát byl centrifugován při 12 000 × g po dobu 10 minut při 4 °C k sedimentaci úlomků a supernatant byl skladován při -80 °C. Aktivita CS byla kvantifikována ve dvou opakováních pomocí testovací sady podle pokynů výrobce (CS0720: Sigma-Aldrich, Dorset, UK). Stručně řečeno, endogenní aktivita byla zaznamenána prostřednictvím barevné emise DTNB a celková aktivita byla vypočtena po přidání oxalacetátu. Koncentrace proteinu byla stanovena ve dvou opakováních pomocí testovací sady s kyselinou bicinchoninovou (BCA1: Sigma-Aldrich, Dorset, UK), což umožnilo normalizaci hodnot aktivity CS na celkový obsah proteinu (µmol/g/min). Aktivita CS a koncentrace proteinu byly měřeny v 96-jamkových destičkách pomocí mikrodestičkového čtečky při 412 nm a 562 nm (MQX200R2, Biotek instruments, Burlington, USA).

Hodnocené změny delta saturace hemoglobinu

K měření změn v okysličeném, deoxygenovaném a celkovém hemoglobinu (μmol/L) ve skeletálním svalstvu byl použit přístroj NIRO-200NX pomocí blízké infračervené spektroskopie (NIRS) a modifikovaného Beerova-Lambertova zákona. Senzor NIRS (vzdálenost emitor-senzor 4 cm) byl umístěn ve 2/3 vzdálenosti mezi velkým trochanterem a laterálním epikondylem dominantní nohy. U parametrů stanovených MBLL byl referenční bod nastaven po pěti minutách odpočinku v poloze na zádech. Data NIRS byla kontinuálně získávána během testu klidového energetického výdeje po dobu 30 minut, testu maximální oxidace tuků (MFO) na cykloergometru a testu maximální spotřeby kyslíku (VO2max) na cykloergometru. Stručně řečeno, test MFO sestával z přírůstkového úkolu s 3minutovými fázemi začínajícími na 15 W a zvyšujícími se o 15 W v každé fázi až do respiračního výměnného poměru 1. Po 5minutovém odpočinku byl test VO2max zahájen při posledním zatížení MFO s 15W přírůstky každou minutu až do stanovení VO2max.

Hodnocené změny v indexu okysličení tkáně

Zařízení NIRO-200NX bylo použito k měření indexu oxygenace kosterní svalové tkáně (%) pomocí spektroskopie v blízké infračervené oblasti (NIRS), modifikovaného Beerova-Lambertova zákona (MBLL) a prostorově rozlišené spektroskopie. Snímač NIRS (vzdálenost emitor-snímač 4 cm) byl umístěn na 2/3 vzdálenosti mezi velkým trochanterem a laterálním epikondylem dominantní nohy. Pro parametry stanovené MBLL byl referenční bod nastaven po pěti minutách odpočinku v poloze na zádech. Data NIRS byla kontinuálně zaznamenávána během testu klidového energetického výdeje po dobu 30 minut, testu maximální oxidace tuků (MFO) na cykloergometru a testu maximální spotřeby kyslíku (VO2max) na cykloergometru. Stručně řečeno, test MFO spočíval v přírůstkovém úkolu s 3minutovými fázemi začínajícími od 15W a zvyšujícími se o 15W každou fázi až do respiračního výměnného poměru 1. Po 5minutovém odpočinku byl test VO2max zahájen při posledním zatížení MFO s 15W zvýšeními každou minutu až do stanovení VO2max.

Posuzované změny v koncentraci glukózy

Koncentrace glukózy (mg/dL) byla měřena z krevních vzorků odebraných z kubitální žíly po alespoň 8 hodinách lačnění a ve 30, 60, 90, 120 a 180 minutách po požití 75 gramů glukózy (Nuter-tec, 75 g/200 mL, pomerančová příchuť). Účastníci byli den před testováním instruováni, aby zachovali svůj obvyklý životní styl, zdrželi se konzumace alkoholu nebo kofeinu po dobu 24 hodin a vyhnuli se namáhavé fyzické aktivitě po dobu 72 hodin. Krevní vzorky byly centrifugovány při 4000 ot./min po dobu 7 minut a sérum bylo analyzováno. Koncentrace glukózy byly stanoveny pomocí kolorimetrické metody provedené na systému Alinity CI (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL, USA).

Hodnocené změny koncentrace inzulínu

Koncentrace inzulínu (µU/mL) byla měřena z krevních vzorků odebraných z vena antecubiti do zkumavek se separátorem séra po alespoň 8 hodinách lačnění a v 30., 60., 90., 120. a 180. minutě po požití 75 gramů glukózy (Nuter-tec, 75 g/200 mL, pomerančová příchuť). Účastníci byli den před testováním instruováni, aby zachovali svůj obvyklý životní styl, zdrželi se konzumace alkoholu nebo kofeinu po dobu 24 hodin a vyvarovali se intenzivní fyzické aktivity po dobu 72 hodin. Krevní vzorky byly centrifugovány při 4000 ot./min po dobu 7 minut a sérum bylo analyzováno. Koncentrace inzulínu byly stanoveny chemiluminiscenčními imunoanalýzami provedenými na systému Alinity CI (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL, USA).

Posouzené změny inzulinové rezistence: HOMA-IR

Inzulinová rezistence byla odhadnuta pomocí Homeostatického modelu pro hodnocení inzulinové rezistence (HOMA-IR), vypočteného jako inzulin nalačno (µU/ml) vynásobený glukózou nalačno (mg/dl) děleno 405.

Posouzené změny inzulinové senzitivity: Matsudův index

Celková tělesná citlivost na inzulin byla odhadnuta pomocí Matsuda indexu, vypočítaného jako 10 000 / √[(hladina glukózy nalačno (mg/dL) × hladina inzulinu nalačno (µU/mL)) × (průměrná hladina glukózy při orálním glukózovém tolerančním testu (mg/dL) × průměrná hladina inzulinu při orálním glukózovém tolerančním testu (µU/mL))].

Posouzené změny inzulinové senzitivity: Quicki

Citlivost na inzulin byla odhadnuta pomocí Kvantitativního indexu kontroly citlivosti na inzulin (QUICKI), vypočteného jako 1 / [log(hladina inzulinu nalačno (µU/mL)) + log(hladina glukózy nalačno (mg/dL))].

Posouzené změny tělesné hmotnosti

Tělesná hmotnost (v kilogramech, kg) byla měřena pomocí multifrekvenčního bioelektrického impedančního přístroje (TANITA-MC780MA, Tanita Corp., Tokio, Japonsko) po nejméně 8 hodinách půstu. Účastníci byli den před testováním instruováni, aby zachovali svůj obvyklý životní styl, zdrželi se alkoholu nebo kofeinu po dobu 24 hodin a vyvarovali se intenzivní fyzické aktivity po dobu 72 hodin. Účastníci měli na sobě lehké oblečení a bylo jim řečeno, aby se bezprostředně před měřením vymočili.

Hodnocené změny v indexu tělesné hmotnosti

Index tělesné hmotnosti (BMI) v kilogramech na metr čtvereční (kg/m²) byl vypočítán jako tělesná hmotnost (kg) dělená výškou na druhou (m²).

Hodnocené změny tukové hmoty (kilogramy tukové hmoty)

Tuková hmota (kilogramy, kg) byla odhadnuta pomocí multifrekvenční bioelektrické impedance s 8-elektrodovým zařízením (TANITA-MC780MA, Tanita Corp., Tokio, Japonsko) po nejméně 8 hodinách půstu. Účastníci byli den před testováním instruováni, aby udržovali svůj obvyklý životní styl, zdrželi se alkoholu nebo kofeinu po dobu 24 hodin a vyvarovali se intenzivní fyzické aktivity po dobu 72 hodin. Účastníci měli na sobě lehké oblečení a byli požádáni, aby se bezprostředně před měřením vymočili.

Posouzené změny v tukové hmotě (procento tukové hmoty)

Tuková hmota (procento celkové tělesné hmotnosti, %) byla odhadnuta pomocí vícefrekvenční bioelektrické impedance s 8-elektrodovým zařízením (TANITA-MC780MA, Tanita Corp., Tokio, Japonsko) po minimálně 8 hodinách půstu. Účastníci byli den před testováním instruováni, aby zachovali svůj obvyklý životní styl, zdrželi se alkoholu nebo kofeinu po dobu 24 hodin a vyhnuli se intenzivní fyzické aktivitě po dobu 72 hodin. Účastníci měli na sobě lehké oblečení a byli požádáni, aby se bezprostředně před měřením vymočili.

Hodnocené změny v hmotnosti bez tuku (kilogramy hmotnosti bez tuku)

Beztuková hmota (kilogramy, kg) byla odhadnuta pomocí multifrekvenční bioelektrické impedance s 8-elektrodovým zařízením (TANITA-MC780MA, Tanita Corp., Tokio, Japonsko) po minimálně 8 hodinách půstu. Účastníci byli den před testováním instruováni, aby zachovali svůj obvyklý životní styl, zdrželi se alkoholu nebo kofeinu po dobu 24 hodin a vyhnuli se namáhavé fyzické aktivitě po dobu 72 hodin. Účastníci měli na sobě lehké oblečení a byli požádáni, aby se bezprostředně před měřením vymočili.

Posouzené změny v beztukové hmotě (procento beztukové hmoty)

Beztuková hmota (procento celkové tělesné hmotnosti, %) byla odhadnuta pomocí multifrekvenční bioelektrické impedance s 8-elektrodovým zařízením (TANITA-MC780MA, Tanita Corp., Tokio, Japonsko) po alespoň 8 hodinách půstu. Účastníci byli den před testováním instruováni, aby zachovali svůj obvyklý životní styl, zdrželi se alkoholu nebo kofeinu po dobu 24 hodin a vyhnuli se namáhavé fyzické aktivitě po dobu 72 hodin. Účastníci měli na sobě lehké oblečení a byli požádáni, aby se bezprostředně před měřením vymočili.

Posouzené změny v antropometrii: Obvody

Obvod pasu (cm) byl měřen v polovině vzdálenosti mezi dolním postranním okrajem 10. žebra a hřebenem kosti kyčelní, kolmo k podélné ose trupu. Obvod břicha (cm) byl měřen v úrovni pupku, kolmo k podélné ose trupu. Obvod boků (cm) byl měřen v úrovni největšího zadního vyklenutí hýždí, kolmo k podélné ose trupu. Obvod stehna (cm) byl měřen v polovině vzdálenosti mezi velkým chocholíkem a postranním kondylem kosti holenní. Všechna měření byla provedena s účastníkem ve vzpřímeném stoji a v uvolněném stavu. Každé měření bylo provedeno dvakrát a třetí měření bylo provedeno, pokud rozdíl přesáhl 1 %. Byl zaznamenán průměr dvou nejpodobnějších záznamů.

Posouzené změny v antropometrii: Poměr pasu k bokům

Poměr pasu k bokům (WHR) byl vypočítán jako obvod pasu (cm) děleno obvodem boků (cm).

Hodnocené změny v antropometrii: Tloušťka kožní řasy

Tloušťka kožní řasy na stehně byla měřena ve dvou třetinách vzdálenosti od bodu iliospinale (nejnižší část předního horního trnu kyčelní kosti) k hornímu laterálnímu okraji čéšky, nad svalovým bříškem musculus vastus lateralis. Měření byla provedena na dominantní noze. Byly provedena dvě měření a třetí bylo provedeno, pokud rozdíl mezi prvními dvěma překročil 5 %. Byl zaznamenán průměr dvou nejpodobnějších záznamů.

Posouzené změny v tělesném složení: Tělesný tuk a beztuková hmota.

Složení těla bylo odhadnuto pomocí multifrekvenční bioimpedance s 8 elektrodami, která byla dříve validována (TANITA-MC780MA, Tanita Corp., Tokio, Japonsko) s minimálně 8 hodinami půstu a s dodržením těchto pokynů den předem: 1) zachovat svůj obvyklý životní styl, 2) zdržet se konzumace alkoholu nebo kofeinu po dobu 24 hodin a 3) vyhnout se intenzivní fyzické aktivitě 72 hodin před testováním. Dále byli účastníci požádáni, aby se těsně před měřením vymočili.

Pacienti měli na sobě lehké oblečení a zaujali polohu v souladu s pokyny výrobce.

Dále byla změřena tělesná hmotnost stejným zařízením a výška pomocí nástěnného stadiometru (TANITA-LEICESTER HR-001, Tanita Corp., Tokio, Japonsko) za účelem výpočtu indexu tělesné hmotnosti.

Posouzená výška

Výška (metry, m) byla měřena pomocí nástěnného stadiometru (TANITA-LEICESTER HR-001, Tanita Corp., Tokio, Japonsko) s účastníky stojícími v souladu s pokyny výrobce.