Probiotyki w zespole krótkiego jelita

1. Wprowadzenie i cel: Celem tego projektu jest poprawa liniowego wzrostu i przyrostu masy ciała u dzieci z zespołem krótkiego jelita poprzez zmianę ich mikroflory jelitowej, a ostatecznie metabolizmu bakteryjnego jelit.

2. Wstęp: Zespół krótkiego jelita (SBS) występuje, gdy masa jelita jest niewystarczająca do prawidłowego wzrostu i rozwoju. Około 35 dzieci na 100 000 żywych urodzeń jest dotkniętych SBS w Ameryce Północnej i te niemowlęta pozostają zależne od dożylnego żywienia pozajelitowego (PN) przez dłuższy czas. Jednym z głównych wyzwań, przed którymi stoją te dzieci, jest osiągnięcie wystarczającego liniowego wzrostu i przyrostu masy ciała pomimo przyjmowania kalorii przekraczających zapotrzebowanie zdrowych dzieci w tym samym wieku. Problemy ze słabą absorpcją i motoryką jelit oraz zwiększony stan zapalny przyczyniają się do słabego wzrostu u tych pacjentów. Ważnym czynnikiem zdrowej funkcji pozostałego jelita cienkiego jest społeczność drobnoustrojów jelitowych. Wiadomo, że wyczerpanie pewnych grup pożytecznych bakterii jelitowych i ich metabolicznych produktów ubocznych, w szczególności krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych (SCFA), może prowadzić do zapalenia jelit, złego wchłaniania i mniej efektywnego wykorzystania spożywanych kalorii.

   Długoterminowym celem badania jest ustalenie, jak skutecznie zmienić mikroflorę jelitową u dzieci z SBS, aby przywrócić zdrową równowagę i zmaksymalizować wzrost i rozwój. Chociaż dzieci z SBS mają znane zaburzenia mikroflory jelitowej, nie jest jasne, czy podawanie doustnego probiotyku jest skutecznym podejściem do korygowania tych zaburzeń.

   Cel 1: Określenie, czy suplementacja probiotykami może znacząco modulować mikroflorę jelitową i poprawiać wzrost u pacjentów z SBS.

   Cel 2: Określenie stężenia SCFA w kale u dzieci z SBS, w tym otrzymujących probiotyki.

3. Opis badania: Wszystkie kwalifikujące się dzieci otrzymają zgodę w czasie wizyty w przychodni lub podczas pobytu w szpitalu. Zarejestrowani uczestnicy zostaną następnie losowo przydzieleni do grupy „placebo”, gdzie otrzymają standardowe leczenie medyczne i żywieniowe zespołu krótkiego jelita, oprócz 1 ml czystego oleju MCT (trójglicerydy o średniej długości łańcucha) dziennie przez 3 miesiące, lub „terapii probiotycznej”, gdzie otrzymają kombinację Lactobacillus rhamnosus (5 miliardów jednostek tworzących kolonie dziennie) i Lactobacillus johnsonii (200 milionów jednostek tworzących kolonie dziennie) codziennie przez 3 miesiące jako dodatek do standardowej opieki. Randomizacja nie będzie zaślepiona. Wybrano probiotyki, ponieważ zostały dobrze przebadane u niemowląt i dzieci, a u dzieci z SBS i słabym wzrostem wykazano niedobór obu tych gatunków. Wybrano placebo, ponieważ jest jedynym nieaktywnym składnikiem zawartym w zawiesinie probiotyku, jest bezwonne i bez smaku oraz nie ma znanych skutków ubocznych. Probiotyk i olej MCT będą podawane codziennie doustnie lub przez istniejącą rurkę gastrostomijną. Pacjenci, którzy wycofają się z badania lub zostaną wycofani, nie zostaną zastąpieni, a dane od tych osób zostaną włączone do analizy w sposób zgodny z zamiarem leczenia.

Kał (około 200 mg na próbkę) zostanie pobrany w 3 oddzielnych punktach czasowych dla każdego pacjenta (na początku, w środku i na końcu badania). Stolec zostanie pobrany albo podczas pobytu w szpitalu, albo podczas wizyty w przychodni. Jeśli pacjent nie jest w stanie dostarczyć próbki kału, rodzina może pobrać próbkę kału w domu, którą można zamrozić i przynieść na następną wizytę w poradni. Zamrożoną próbkę można wykorzystać do sekwencjonowania 16S rRNA i analizy metabolomicznej, ale nie do oznaczania stężenia SCFA. Mikrobiologiczne gDNA można odzyskać z kału, który był zamrożony przez okres do 6 miesięcy, z podobnymi wynikami sekwencjonowania w porównaniu ze świeżo przetworzonym kałem. Jeśli dostarczona zostanie świeża próbka, porcja zostanie wykorzystana do oznaczenia stężenia SCFA. Kał użyty do sekwencjonowania 16S rRNA i metabolomiki będzie przechowywany w stanie zamrożonym do czasu przeprowadzenia analizy. Jednorazowa próbka kału zostanie również pobrana od 10 kontrolnych pacjentów z zespołem krótkiego jelita, którzy rozwijają się prawidłowo i zostanie wykorzystana do analizy 16S rRNA i analizy metabolomicznej.

Kał użyty do sekwencjonowania 16S rRNA będzie przechowywany w stanie zamrożonym do czasu analizy. Bakteryjny gDNA zostanie następnie wyekstrahowany z zawartości kału. Amplikony bakteryjnych genów 16S rRNA zostaną wygenerowane i zsekwencjonowane przy użyciu Illumina Hi-Seq 2000 (UTSW Genomics Core). Odczyty sekwencjonowania będą filtrowane, a jakość przycinana i analizowana za pomocą pakietu oprogramowania QIIME.59 Różnorodność drobnoustrojów zostanie oszacowana poprzez obliczenie wskaźnika różnorodności Shannona i wskaźnika odmienności Braya-Curtisa.

Liczebność bakterii zostanie określona przy użyciu krzywych wzorcowych skonstruowanych w odniesieniu do sklonowanego bakteryjnego DNA odpowiadającego krótkiemu segmentowi genu 16S rRNA, który zamplifikowano z bakteryjnych szczepów referencyjnych.63 Dr Koh dokonał również walidacji protokołów qPCR dla 6 określonych grup bakterii: 1) Eubacteria (wszystkie bakterie); 2) Lactobacillus (podgrupa Firmicutes); 3) Bacteroides (podzbiór Bacteroidetes); 4) Enterobacteriaceae (ENTERO; prozapalne bakterie Gram-ujemne, takie jak E. coli, Klebsiella spp, itp.); 5) CLEPT (podgrupa Firmicutes; przeciwzapalne Clostridia wytwarzające maślan); 6) EREC (podzbiór Firmicutes; Clostridia wytwarzające maślan o działaniu przeciwzapalnym). Metoda qPCR specyficzna dla grupy bakterii zapewnia ilościową ocenę ogólnej liczebności określonych grup bakterii

Stężenia SCFA w kale będą mierzone we wszystkich punktach czasowych, w których można dostarczyć świeżą próbkę. Pokrótce, świeże próbki kału zostaną zważone, zawieszone w wodzie z 0,5% kwasem fosforowym, a następnie natychmiast zamrożone w ciekłym azocie. Biorąc pod uwagę lotność SCFA, błyskawiczne zamrażanie zapewni dokładniejsze pomiary. Zawiesiny kałowe będą następnie rozmrażane, homogenizowane i ekstrahowane octanem etylu. Ekstrakty organiczne zostaną wzbogacone standardami SCFA znakowanymi węglem (w celu dokładnego określenia ilościowego poziomów SCFA) i poddane analizie GC-MS.

Randomizacja: Włączeni pacjenci zostaną przydzieleni losowo przy użyciu scentralizowanego procesu opartego na losowej tabeli. Randomizacja zostanie ustalona poprzez zadzwonienie na numer telefonu projektu centralnego, na który odpowiada pielęgniarka badawcza i poproszenie o identyfikator pacjenta oraz przydział do standardowego leczenia lub operacji warunkowej. Jest to badanie otwarte, a pacjenci zostaną losowo przydzieleni w stosunku 1:1 do jednej z dwóch grup terapeutycznych.

Faza leczenia:

Pacjenci otrzymujący placebo otrzymają standardowe leczenie medyczne i żywieniowe zespołu krótkiego jelita, oprócz codziennego oleju MCT. Wszyscy włączeni pacjenci zostaną poddani szczegółowej ocenie wzrostu podczas badania. Podstawowe antropometryczne miary wzrostu będą obejmowały wagę, wzrost, obwód głowy (dla dzieci

Informacje kliniczne będą również gromadzone z dokumentacji medycznej wszystkich włączonych pacjentów, w tym informacje o wieku, płci, pochodzeniu etnicznym, etiologii SBS, jakości i częstotliwości codziennych wypróżnień, stosowaniu antybiotyków w ciągu 4 tygodni przed włączeniem do badania i podczas badania, zakażeniach w trakcie badania wywiad chirurgiczny, w tym wszelkie zabiegi wydłużające jelito, długość i anatomia pozostałego jelita cienkiego i okrężnicy, obecność stomii i/lub gastrostomii, wywiad lekarski, przyjmowane leki, szczegółowe informacje żywieniowe (spożycie kalorii z żywienia pozajelitowego i dojelitowego) odżywianie) i rutynowe badania krwi dotyczące żywienia. Przeprowadzona zostanie krokowa analiza regresji logistycznej tych cech klinicznych w celu modelowania niezależnych predyktorów słabego wzrostu, przy użyciu poziomu istotności p

Grupa Probiotyczna – gdzie oprócz standardowej opieki otrzymają kombinację Lactobacillus rhamnosus (5 miliardów jednostek tworzących kolonie dziennie) i Lactobacillus johnsonii (200 milionów jednostek tworzących kolonie dziennie) przez 3 miesiące.

Próbki kału zostaną pobrane przez obie grupy w 3 oddzielnych punktach czasowych dla każdego pacjenta, po wstępnej rejestracji, w punkcie środkowym i na końcu badania). Próbki zostaną pobrane podczas wizyty w przychodni standardowej, podczas pobytu w szpitalu lub w domu przez opiekuna i zamrożone. Opiekunowie otrzymają instrukcje i zestawy do pobierania kału.