Probiotika u syndromu krátkého střeva

1. Úvod a účel: Cílem tohoto projektu je zlepšit lineární růst a přírůstek hmotnosti u dětí se syndromem krátkého střeva změnou jejich střevní mikrobioty a v konečném důsledku i střevního bakteriálního metabolismu.

2. Souvislosti: Syndrom krátkého střeva (SBS) se vyskytuje, když je nedostatek střevní hmoty k podpoře normálního růstu a vývoje. Přibližně 35 dětí z každých 100 000 živě narozených dětí je v Severní Americe postiženo SBS a tyto děti zůstávají závislé na intravenózní, parenterální výživě (PN) po dlouhou dobu. Jednou z hlavních výzev, kterým tyto děti čelí, je dosažení dostatečného lineárního růstu a přírůstku hmotnosti navzdory příjmu kalorií nad rámec toho, co potřebují zdravé děti stejného věku. Problémy se špatnou střevní absorpcí a motilitou a zvýšeným zánětem přispívají ke špatnému růstu těchto pacientů. Důležitým faktorem zdravé funkce zbývajícího tenkého střeva je střevní mikrobiální komunita. Je známo, že vyčerpání určitých skupin prospěšných střevních bakterií a jejich metabolických vedlejších produktů, konkrétně mastných kyselin s krátkým řetězcem (SCFA), může vést ke střevním zánětům, malabsorpci a méně efektivnímu využití spotřebovaných kalorií.

   Dlouhodobým cílem studie je zjistit, jak účinně změnit střevní mikroflóru u dětí s SBS, aby se obnovila zdravá rovnováha a maximalizoval růst a vývoj. Ačkoli děti s SBS mají známé poruchy jejich střevní mikroflóry, není jasné, zda je podávání perorálních probiotik účinným přístupem k nápravě těchto poruch.

   Cíl 1: Zjistit, zda suplementace probiotik může významně modulovat střevní mikroflóru a zlepšit růst u pacientů se SBS.

   Cíl 2: Stanovit hladiny fekálních SCFA u dětí s SBS, včetně těch, které dostávají probiotika.

3. Popis studie: Všechny způsobilé děti obdrží souhlas v době návštěvy ambulance nebo během hospitalizace. Zapsaní účastníci budou poté randomizováni do „placeba“, kde budou dostávat standardní lékařskou a nutriční léčbu syndromu krátkého střeva navíc k 1 ml čistého MCT (medium chain triglyceride) oleje denně po dobu 3 měsíců nebo „probiotickou terapii“, kde budou dostávat kombinaci Lactobacillus rhamnosus (5 miliard jednotek tvořících kolonie denně) a Lactobacillus johnsonii (200 milionů jednotek tvořících kolonie denně) denně po dobu 3 měsíců navíc ke standardní péči. Randomizace nebude zaslepena. Probiotika byla vybrána, protože byla dobře studována u kojenců a dětí a u obou těchto druhů byl zjištěn nedostatek u dětí se SBS a špatným růstem. Placebo bylo vybráno, protože je jedinou neaktivní složkou obsaženou v suspenzi probiotika, je bez zápachu a chuti a nemá žádné známé vedlejší účinky. Probiotikum a MCT olej budou podávány denně buď perorálně, nebo prostřednictvím stávající gastrostomické sondy. Pacienti, kteří vystoupí ze studie nebo kteří budou staženi, nebudou nahrazeni a data od těchto subjektů budou zahrnuta jako součást analýzy způsobem záměrné léčby.

Stolice (přibližně 200 mg na vzorek) bude odebrána ve 3 samostatných časových bodech pro každého pacienta (na začátku, uprostřed a na konci studie). Stolice bude odebrána buď při pobytu na lůžku, nebo při návštěvě ambulance. Pokud pacient není schopen poskytnout vzorek stolice, rodina si jej může odebrat doma a může být zmražen a přinesen při příští návštěvě kliniky. Zmrazený vzorek lze použít pro sekvenování 16S rRNA a metabolomickou analýzu, ale ne pro koncentraci SCFA. Mikrobiální gDNA lze získat ze stolice, která byla zmražena po dobu až 6 měsíců, s podobnými výsledky sekvenování ve srovnání s čerstvě zpracovanou stolicí. Pokud je poskytnut čerstvý vzorek, jeho část se použije ke stanovení koncentrace SCFA. Stolice použitá pro sekvenování 16S rRNA a metabolomiku bude až do provedení analýzy uchovávána zmrazená. Jednorázový odběr stolice bude také získán od 10 kontrolních pacientů se syndromem krátkého střeva, kteří dobře rostou, a bude použit pro analýzu 16S rRNA a metabolomickou analýzu.

Stolice použitá pro sekvenování 16S rRNA bude až do doby analýzy uchovávána zmrazená. Bakteriální gDNA pak bude extrahována z obsahu stolice. Amplikony bakteriálních genů 16S rRNA budou generovány a sekvenovány pomocí Illumina Hi-Seq 2000 (UTSW Genomics Core). Sekvenační čtení budou filtrována a kvalitativně oříznuta a analyzována pomocí softwarového balíčku QIIME.59 Mikrobiální diverzita bude odhadnuta výpočtem Shannonova indexu diverzity a Bray-Curtisova indexu odlišnosti.

Bakteriální četnost bude stanovena pomocí standardních křivek konstruovaných s odkazem na klonovanou bakteriální DNA odpovídající krátkému segmentu genu 16S rRNA, který byl amplifikován z bakteriálních referenčních kmenů.63 Dr. Koh také ověřil protokoly qPCR pro 6 specifických skupin bakterií: 1) Eubacteria (všechny bakterie); 2) Lactobacillus (podskupina firmicutes); 3) Bacteroides (podskupina Bacteroidetes); 4) Enterobacteriaceae (ENTERO; prozánětlivé gramnegativní látky, jako je E. coli, Klebsiella spp, atd.); 5) CLEPT (podskupina Firmicutes; butyrát produkující protizánětlivé Clostridia); 6)EREC (podskupina Firmicutes; butyrát produkující protizánětlivé Clostridia). Bakteriální skupina specifická qPCR poskytuje kvantifikaci celkového množství specifických skupin bakterií

Koncentrace SCFA ve stolici budou měřeny ve všech časových bodech, kdy může být poskytnut čerstvý vzorek. Stručně řečeno, čerstvé vzorky stolice budou zváženy, suspendovány ve vodě s 0,5% kyselinou fosforečnou a poté okamžitě zmraženy kapalným dusíkem. Vzhledem k volatilitě SCFA poskytne bleskové zmrazení přesnější měření. Fekální suspenze se pak rozmrazí, homogenizují a extrahují ethylacetátem. Organické extrakty budou obohaceny standardy SCFA značenými uhlíkem (aby bylo možné přesně kvantifikovat hladiny SCFA) a zpracovány na GC-MS.

Randomizace: Zařazení pacienti budou randomizováni pomocí centralizovaného procesu založeného na náhodné tabulce. Randomizace bude určena zavoláním na centrální telefonní číslo projektu zodpovězené výzkumnou sestrou a vyžádáním ID subjektu a přidělení buď standardní léčby, nebo podmíněné operace. Toto je otevřená studie a pacienti budou randomizováni v poměru 1:1 do jednoho ze dvou léčebných ramen.

Fáze léčby:

Pacienti s placebem dostanou kromě denního MCT oleje standardní lékařskou a nutriční léčbu syndromu krátkého střeva. Všichni zařazení pacienti budou mít během studie podrobné hodnocení růstu. Primární antropometrické míry růstu budou zahrnovat váhu, výšku, obvod hlavy (u dětí

Klinické informace budou také shromažďovány ze zdravotních záznamů všech zařazených pacientů, včetně informací o věku, pohlaví, etnickém původu, etiologii SBS, kvalitě a frekvenci denní stolice, užívání antibiotik během 4 týdnů před zařazením a během studie, infekcích. během studie chirurgická anamnéza, včetně všech procedur prodlužujících střevo, délka a anatomie tenkého střeva a zbývajícího tlustého střeva, přítomnost stomie a/nebo gastrostomické sondy, anamnéza, léky, podrobné nutriční informace (kalorický příjem z parenterálního a enterálního výživa) a rutinní nutriční krevní práce. Bude provedena postupná logistická regresní analýza těchto klinických charakteristik za účelem modelování nezávislých prediktorů slabého růstu s použitím hladiny významnosti p

Probiotická skupina – kde budou denně po dobu 3 měsíců nad rámec standardní péče dostávat kombinaci Lactobacillus rhamnosus (5 miliard jednotek tvořících kolonie denně) a Lactobacillus johnsonii (200 milionů jednotek tvořících kolonie denně).

Vzorky stolice budou odebírány oběma skupinám ve 3 samostatných časových bodech pro každého pacienta, po počátečním zařazení, uprostřed a na konci studie). Vzorky budou odebrány při návštěvě kliniky standardní péče, během hospitalizace nebo doma pečovatelem a zmraženy. Ošetřovatelům budou poskytnuty instrukce a sady pro odběr stolice.