Probióticos na Síndrome do Intestino Curto

1. Introdução e Objetivo: O objetivo deste projeto é melhorar o crescimento linear e o ganho de peso em crianças com síndrome do intestino curto, alterando sua microbiota intestinal e, finalmente, o metabolismo bacteriano intestinal.

2. Introdução: A síndrome do intestino curto (SIC) ocorre quando há massa intestinal insuficiente para sustentar o crescimento e desenvolvimento normais. Aproximadamente 35 bebês em cada 100.000 nascidos vivos são afetados pela SBS na América do Norte, e esses bebês permanecem dependentes de nutrição parenteral (NP) intravenosa por um período prolongado de tempo. Um dos maiores desafios que essas crianças enfrentam é alcançar crescimento linear e ganho de peso suficientes, apesar de receberem calorias em excesso do que o exigido por crianças saudáveis ​​de mesma idade. Problemas com absorção e motilidade intestinais deficientes e aumento da inflamação contribuem para o crescimento deficiente nesses pacientes. Um fator importante na função saudável do intestino delgado restante é a comunidade microbiana intestinal. Sabe-se que a depleção de certos grupos de bactérias intestinais benéficas e seus subprodutos metabólicos, especificamente os ácidos graxos de cadeia curta (SCFAs) podem levar à inflamação intestinal, má absorção e uso menos eficiente das calorias consumidas.

   O objetivo de longo prazo do estudo é determinar como mudar efetivamente a microbiota intestinal em crianças com SBS para restaurar um equilíbrio saudável e maximizar o crescimento e o desenvolvimento. Embora as crianças com SBS tenham distúrbios conhecidos em sua microbiota intestinal, não está claro se o fornecimento de um probiótico oral é uma abordagem eficaz para corrigir esses distúrbios.

   Objetivo 1: determinar se a suplementação probiótica pode modular significativamente a microbiota intestinal e melhorar o crescimento em pacientes com SBS.

   Objetivo 2: Determinar os níveis de SCFAs fecais em crianças com SBS, incluindo aquelas que recebem probióticos.

3. Descrição do estudo: Todas as crianças elegíveis serão consentidas no momento de uma consulta ambulatorial ou durante uma internação. Os participantes inscritos serão randomizados para "placebo", onde receberão o tratamento médico e nutricional padrão para a síndrome do intestino curto, além de 1mL de óleo MCT (triglicerídeos de cadeia média) puro diariamente por 3 meses, ou "terapia probiótica", onde eles receberão uma combinação de Lactobacillus rhamnosus (5 bilhões de unidades formadoras de colônias por dia) e Lactobacillus johnsonii, (200 milhões de unidades formadoras de colônias por dia) diariamente por 3 meses, além do tratamento padrão. A randomização não será cega. Os probióticos foram escolhidos porque foram bem estudados em lactentes e crianças e ambas as espécies foram consideradas deficientes em crianças com SBS e baixo crescimento. O placebo foi escolhido por ser o único ingrediente inativo incluído na suspensão do probiótico, ser inodoro e insípido e não apresentar efeitos colaterais conhecidos. O probiótico e o óleo MCT serão administrados diariamente por via oral ou através de um tubo de gastrostomia existente. Os pacientes que abandonarem o estudo ou forem retirados não serão substituídos, e os dados desses indivíduos serão incluídos como parte da análise de maneira intencional de tratar.

As fezes (aproximadamente 200 mg por amostra) serão coletadas em 3 pontos de tempo separados para cada paciente (no início, meio e final do estudo). As fezes serão coletadas durante uma internação ou em uma consulta ambulatorial. Se um paciente não puder fornecer uma amostra de fezes, a família pode coletar uma em casa e congelá-la e trazê-la na próxima consulta clínica. Uma amostra congelada pode ser usada para sequenciamento de rRNA 16S e análise metabolômica, mas não para concentração de SCFA. O gDNA microbiano pode ser recuperado de fezes congeladas por até 6 meses, com resultados de sequenciamento semelhantes em comparação com fezes recém-processadas. Se uma amostra fresca for fornecida, uma porção será usada para determinar a concentração de SCFAs. As fezes usadas para sequenciamento de 16S rRNA e metabolômica serão mantidas congeladas até que a análise seja realizada. Uma coleta única de fezes também será obtida de 10 pacientes de controle com síndrome do intestino curto que estão crescendo bem e será usada para 16S rRNA e análise metabolômica.

As fezes utilizadas para o sequenciamento do rRNA 16S serão mantidas congeladas até o momento da análise. O gDNA bacteriano será então extraído do conteúdo fecal. Amplicons dos genes 16S rRNA bacterianos serão gerados e sequenciados usando o Illumina Hi-Seq 2000 (UTSW Genomics Core). As leituras de sequenciamento serão filtradas e a qualidade ajustada e analisada usando o pacote de software QIIME.59 A diversidade microbiana será estimada por meio do cálculo do índice de diversidade de Shannon e do índice de dissimilaridade de Bray-Curtis.

A abundância bacteriana será determinada usando curvas padrão construídas com referência ao DNA bacteriano clonado correspondente a um segmento curto do gene 16S rRNA que foi amplificado a partir de cepas bacterianas de referência.63 Dr. Koh também validou protocolos qPCR para 6 grupos específicos de bactérias: 1) Eubactérias (todas as bactérias); 2) Lactobacillus (um subconjunto de firmicutes); 3) Bacteroides (um subconjunto de Bacteroidetes); 4) Enterobacteriaceae (ENTERO; gram-negativas pró-inflamatórias como E.coli, Klebsiella spp, etc); 5) CLEPT (um subconjunto de Firmicutes; clostrídios anti-inflamatórios produtores de butirato); 6)EREC (um subconjunto de Firmicutes; clostrídios anti-inflamatórios produtores de butirato). O qPCR específico do grupo bacteriano fornece a quantificação da abundância geral de grupos específicos de bactérias

As concentrações de SCFAs nas fezes serão medidas em todos os momentos em que uma nova amostra puder ser fornecida. Resumidamente, amostras fecais frescas serão pesadas, suspensas em água com 0,5% de ácido fosfórico e então congeladas imediatamente com nitrogênio líquido. Dada a volatilidade dos SCFAs, o congelamento rápido fornecerá medições mais precisas. As suspensões fecais serão então descongeladas, homogeneizadas e extraídas com acetato de etila. Os extratos orgânicos serão enriquecidos com padrões SCFA marcados com carbono (para quantificar com precisão os níveis de SCFA) e executados no GC-MS.

Randomização: Os pacientes inscritos serão randomizados usando um processo centralizado baseado em uma tabela aleatória. A randomização será determinada ligando para um número de telefone central do projeto atendido pela enfermeira da pesquisa e solicitando uma identificação do sujeito e uma alocação para tratamento padrão ou cirurgia condicional. Este é um estudo aberto e os pacientes serão randomizados de maneira 1:1 para um dos dois braços de tratamento.

Fase do tratamento:

Os pacientes com placebo receberão o tratamento médico e nutricional padrão para a síndrome do intestino curto, além do óleo MCT diário. Todos os pacientes inscritos terão avaliação detalhada do crescimento durante o estudo. As medidas antropométricas primárias de crescimento incluirão peso, altura, perímetro cefálico (para crianças

Informações clínicas também serão coletadas dos registros médicos de todos os pacientes inscritos, incluindo informações sobre idade, sexo, etnia, etiologia da SBS, qualidade e frequência das evacuações diárias, uso de antibióticos nas 4 semanas anteriores à inscrição e durante o estudo, infecções durante o estudo, histórico cirúrgico, incluindo qualquer procedimento de alongamento do intestino, comprimento e anatomia do intestino delgado e cólon remanescente, presença de um estoma e/ou tubo de gastrostomia, histórico médico, medicamentos, informações nutricionais detalhadas (ingestão calórica de parenteral e enteral nutrição) e exames de sangue nutricionais de rotina. A análise de regressão logística stepwise dessas características clínicas será realizada para modelar os preditores independentes de baixo crescimento, usando um nível de significância de p

Grupo Probiótico - onde receberão uma combinação de Lactobacillus rhamnosus (5 bilhões de unidades formadoras de colônias por dia) e Lactobacillus johnsonii (200 milhões de unidades formadoras de colônias por dia) diariamente por 3 meses além do padrão de atendimento.

Amostras de fezes serão coletadas por ambos os grupos em 3 pontos de tempo separados para cada paciente, na inscrição inicial, no meio e no final do estudo). As amostras serão coletadas em uma visita clínica padrão de atendimento, durante uma internação ou em casa pelo cuidador e congeladas. Os cuidadores receberão instruções e kits de coleta de fezes.